Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan təqdim edəcəyik.
Toxoplasma gondii, yoluxmuş ev sahibinin mikromühitini modulyasiya edən hüceyrədaxili protozoan parazitdir və beyin şişinin böyüməsi ilə əlaqəli olduğu bilinir.Bu araşdırmada biz Toxoplasma infeksiyasından olan ekzosomal miRNA-21-in beyin şişinin böyüməsini təşviq etdiyini fərz edirik.Toksoplazma ilə yoluxmuş BV2 mikroqliyasından olan ekzosomlar səciyyələndirilmiş və U87 glioma hüceyrələrinin daxililəşdirilməsi təsdiqlənmişdir.Toxoplasma gondii və şişlərin çeşidlənməsi ilə əlaqəli mikroRNT və microRNA-21A-5p massivlərindən istifadə etməklə ekzosomal mikroRNT ifadə profilləri təhlil edilmişdir.Biz həmçinin ekzosomlarda miR-21 səviyyələrini dəyişdirərək U87 glioma hüceyrələrində şişlə əlaqəli genlərin mRNA səviyyələrini və ekzosomların insan U87 glioma hüceyrələrinin yayılmasına təsirini araşdırdıq.Toxoplasma gondii ilə yoluxmuş U87 glioma hüceyrələrinin ekzosomlarında mikroRNT-21-in ifadəsi artır və şiş əleyhinə genlərin (FoxO1, PTEN və PDCD4) aktivliyi azalır.Toksoplazma ilə yoluxmuş BV2 mənşəli ekzosomlar U87 glioma hüceyrələrinin proliferasiyasına səbəb olur.Ekzosomlar siçan şişi modelində U87 hüceyrələrinin böyüməsinə səbəb olur.Biz təklif edirik ki, Toksoplazma ilə yoluxmuş BV2 mikroqliyasında artan ekzosomal miR-21 antitümör genlərini aşağı tənzimləyərək U87 glioma hüceyrələrində hüceyrə böyüməsi stimulatoru kimi mühüm rol oynaya bilər.
Hesablamalara görə, 2018-ci ildə dünyada 18,1 milyondan çox inkişaf etmiş xərçəng hadisəsi diaqnozu qoyulub və hər il təxminən 297 000 mərkəzi sinir sistemi şişi diaqnozu qoyulur (bütün şişlərin 1,6%-i)1.Əvvəlki tədqiqatlar göstərdi ki, insan beyin şişlərinin inkişafı üçün risk faktorlarına müxtəlif kimyəvi məhsullar, ailə tarixi və baş terapevtik və diaqnostik avadanlıqdan gələn ionlaşdırıcı şüalanma daxildir.Ancaq bu bədxassəli şişlərin dəqiq səbəbi məlum deyil.Dünyadakı bütün xərçənglərin təxminən 20%-i viruslar, bakteriya və parazitlər daxil olmaqla yoluxucu agentlər tərəfindən törədilir3,4.Yoluxucu patogenlər ev sahibi hüceyrənin DNT təmiri və hüceyrə dövrü kimi genetik mexanizmlərini pozur və xroniki iltihaba və immun sisteminin zədələnməsinə səbəb ola bilər5.
İnsan xərçəngi ilə əlaqəli yoluxucu agentlər insan papillomavirusları və hepatit B və C virusları da daxil olmaqla ən çox yayılmış viral patogenlərdir.Parazitlər də insan xərçənginin inkişafında potensial rol oynaya bilər.Bir neçə parazit növləri, yəni Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis və Hymenolepis nana, insan xərçənginin müxtəlif növlərində iştirak etmişdir 6,7,8.
Toxoplasma gondii yoluxmuş ev sahibi hüceyrələrin mikromühitini tənzimləyən hüceyrədaxili protozoadır.Bu parazitin dünya əhalisinin təxminən 30%-nə yoluxduğu təxmin edilir və bütün əhali risk altındadır9,10.Toxoplasma gondii mərkəzi sinir sistemi (MSS) daxil olmaqla həyati vacib orqanlara yoluxa bilər və xüsusilə immun çatışmazlığı olan xəstələrdə ölümcül meningit və ensefalit kimi ciddi xəstəliklərə səbəb ola bilər9.Bununla belə, Toxoplasma gondii immunokompetent şəxslərdə hüceyrə artımını və immun reaksiyalarını modulyasiya etməklə yoluxmuş ev sahibinin mühitini də dəyişə bilər, bu da asimptomatik xroniki infeksiyanın saxlanmasına gətirib çıxarır9,11.Maraqlıdır ki, T. gondii yayılması və beyin şişi tezliyi arasında korrelyasiya nəzərə alınmaqla, bəzi hesabatlar göstərir ki, xroniki T. gondii infeksiyası nəticəsində in vivo ev sahibi ətraf mühit dəyişiklikləri şiş mikromühitinə bənzəyir.
Ekzosomlar, qonşu hüceyrələrdən zülallar və nuklein turşuları daxil olmaqla, bioloji məzmunu çatdıran hüceyrələrarası kommunikatorlar kimi tanınır16,17.Ekzosomlar şiş mikromühitində antiapoptoz, angiogenez və metastaz kimi şişlə əlaqəli bioloji proseslərə təsir göstərə bilər.Xüsusilə, miRNA-lar (miRNA-lar), uzunluğu təxminən 22 nukleotid olan kiçik kodlaşdırmayan RNT-lər miRNA-induksiya etdiyi susdurma kompleksi (miRISC) vasitəsilə insan mRNT-nin 30%-dən çoxunu idarə edən mühüm post-transkripsiya gen tənzimləyiciləridir.Toxoplasma gondii yoluxmuş hostlarda miRNT ifadəsini idarə edərək bioloji prosesləri poza bilər.Host miRNA-ları parazitin sağ qalma strategiyasına nail olmaq üçün ev sahibi bioloji prosesləri tənzimləmək üçün vacib siqnalları ehtiva edir.Beləliklə, T. gondii ilə yoluxma zamanı ev sahibi miRNT profilindəki dəyişiklikləri öyrənmək bizə ev sahibi ilə T. gondii arasındakı qarşılıqlı əlaqəni daha aydın başa düşməyə kömək edə bilər.Həqiqətən, Thirugnanam et al.15 təklif etdi ki, T. gondii şiş böyüməsi ilə əlaqəli xüsusi host miRNA-larda ifadəsini dəyişdirərək beyin kanserogenezini təşviq edir və T. gondii-nin eksperimental heyvanlarda gliomalara səbəb ola biləcəyini tapdı.
Bu tədqiqat Toxoplasma BV2 ilə yoluxmuş ev sahibi mikroglialarda ekzosomal miR-21-in dəyişdirilməsinə yönəlmişdir.Həddindən artıq ifadə edilmiş miR-21-in hədəfi olan FoxO1/p27 nüvəsində saxlanması səbəbindən U87 glioma hüceyrələrinin böyüməsində dəyişdirilmiş ekzosomal miR-21-in mümkün rolunu müşahidə etdik.
BV2-dən əldə edilən ekzosomlar diferensial sentrifuqasiyadan istifadə etməklə əldə edilmiş və hüceyrə komponentləri və ya digər veziküllərlə çirklənmənin qarşısını almaq üçün müxtəlif üsullarla təsdiq edilmişdir.SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) BV2 hüceyrələrindən və ekzosomlardan çıxarılan zülallar arasında fərqli nümunələr göstərdi (Şəkil 1A) və nümunələr Alix-in mövcudluğuna görə qiymətləndirildi, bu da ekzosomal zülal markerlərinin Western blotlanması ilə təhlil edildi.Aliks etiketlənməsi ekzosom zülallarında tapıldı, lakin BV2 hüceyrə lizat zülallarında tapılmadı (Şəkil 1B).Bundan əlavə, BV2-dən əldə edilən ekzosomlardan təmizlənmiş RNT bioanalizatordan istifadə edərək təhlil edilmişdir.18S və 28S ribosomal alt bölmələri nadir hallarda ekzosomal RNT miqrasiya modelində müşahidə edildi, bu etibarlı təmizliyi göstərir (Şəkil 1C).Nəhayət, ötürücü elektron mikroskopiya müşahidə etdi ki, müşahidə olunan ekzosomlar təqribən 60-150 nm ölçüdə olub və ekzosom morfologiyasına xas olan kubokvari struktura malikdir (Şəkil 1D).
BV2 hüceyrələrindən alınan ekzosomların xarakteristikası.(A) Təhlükəsizlik məlumat vərəqinin səhifəsi.Zülallar BV2 hüceyrələrindən və ya BV2-dən alınan ekzosomlardan təcrid edilmişdir.Zülal nümunələri hüceyrələr və ekzosomlar arasında fərqlənir.(B) Ekzosomal markerin Western blot analizi (Aliks).(C) Bioanalizatordan istifadə edərək BV2 hüceyrələrindən və BV2 əldə edilmiş ekzosomlardan təmizlənmiş RNT-nin qiymətləndirilməsi.Beləliklə, BV2 hüceyrələrində 18S və 28S ribosomal subunitlər nadir hallarda ekzosomal RNT-də tapıldı.(D) Transmissiya elektron mikroskopiyası göstərdi ki, BV2 hüceyrələrindən təcrid olunmuş ekzosomlar 2% uranil asetatla mənfi şəkildə boyanmışdır.Ekzosomlar təqribən 60-150 nm ölçüdə və kubok şəklindədir (Song və Jung, nəşr olunmamış məlumatlar).
BV2-dən alınan ekzosomların U87 insan glioma hüceyrələrinə hüceyrə daxililəşdirilməsi konfokal mikroskopiyadan istifadə etməklə müşahidə edilmişdir.PKH26 etiketli ekzosomlar U87 hüceyrələrinin sitoplazmasında lokallaşdırılmışdır.Nüvələr DAPI ilə boyandı (Şəkil 2A), bu, BV2-dən əldə edilən ekzosomların ev sahibi hüceyrələr tərəfindən daxililəşdirilə biləcəyini və alıcı hüceyrələrin mühitinə təsir göstərə biləcəyini göstərir.
BV2 mənşəli ekzosomların U87 glioma hüceyrələrinə və Toxoplasma RH ilə yoluxmuş BV2 törəmə ekzosomlara daxil edilməsi U87 glioma hüceyrələrinin proliferasiyasına səbəb oldu.(A) Konfokal mikroskopiya ilə ölçülən U87 hüceyrələri tərəfindən udulmuş ekzosomlar.U87 glioma hüceyrələri PKH26 (qırmızı) ilə etiketlənmiş və ya nəzarətsiz 24 saat ərzində ekzosomlarla inkubasiya edilmişdir.Nüvələr DAPI (mavi) ilə boyandı və sonra konfokal mikroskop altında müşahidə edildi (miqyas çubuğu: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioma hüceyrə proliferasiyası hüceyrə proliferasiya analizi ilə müəyyən edilmişdir.U87 glioma hüceyrələri göstərilən müddət ərzində ekzosomlarla müalicə edildi. *P < 0.05 Student's t testi ilə əldə edilmişdir. *P < 0.05 Student's t testi ilə əldə edilmişdir. *P < 0,05 t-kriteriyə uyğundur. *Tələbənin t-testi ilə P <0,05. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P < 0,05, t-kriteriya Styudenta. * P < 0.05 Tələbənin t-testindən istifadə etməklə əldə edilmişdir.
BV2-dən əldə edilən ekzosomların U87 glioma hüceyrələrinə daxil edilməsini təsdiq etdikdən sonra, insan glioma hüceyrələrinin inkişafında BV2-dən alınan Toksoplazmadan əldə edilən ekzosomların rolunu araşdırmaq üçün hüceyrə proliferasiya analizlərini həyata keçirdik.U87 hüceyrələrinin T. gondii ilə yoluxmuş BV2 hüceyrələrindən olan ekzosomlarla müalicəsi göstərdi ki, T. gondii ilə yoluxmuş BV2 törəmə ekzosomlar nəzarətlə müqayisədə U87 hüceyrələrinin əhəmiyyətli dərəcədə daha çox yayılmasına səbəb olur (Şəkil 2B).
Bundan əlavə, U118 hüceyrələrinin böyüməsi U87 ilə eyni nəticələr verdi, çünki Toksoplazmanın stimullaşdırdığı ekzosomlar ən yüksək proliferasiya səviyyəsinə səbəb oldu (məlumatlar göstərilmir).Bu məlumatlara əsaslanaraq, BV2 mənşəli Toksoplazma ilə yoluxmuş ekzosomların glioma hüceyrələrinin yayılmasında mühüm rol oynadığını göstərə bilərik.
Toksoplazma ilə yoluxmuş BV2 mənşəli ekzosomların şiş inkişafına təsirini araşdırmaq üçün biz U87 qlioma hüceyrələrini ksenoqraft modeli üçün çılpaq siçanlara yeritdik və BV2 törəmə ekzosomları və ya RH ilə yoluxmuş BV2 törəmə ekzosomları yeritdik.Şişlər 1 həftə sonra aşkar edildikdən sonra, eyni başlanğıc nöqtəsini təyin etmək üçün 5 siçandan ibarət hər bir eksperimental qrup şiş ölçüsünə görə bölündü və şiş ölçüsü 22 gün ərzində ölçüldü.
U87 ksenoqraft modeli olan siçanlarda 22-ci gündə BV2 törəmə RH ilə yoluxmuş ekzosom qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə daha böyük şiş ölçüsü və çəkisi müşahidə edilmişdir (Şəkil 3A,B).Digər tərəfdən, BV2 törəmə ekzosom qrupu ilə ekzosom müalicəsindən sonra nəzarət qrupu arasında şiş ölçüsündə əhəmiyyətli fərq yox idi.Bundan əlavə, glioma hüceyrələri və exosomes ilə enjekte siçanlar vizual RH ilə yoluxmuş BV2 törəmə exosomes (Şəkil. 3C) qrupunda ən böyük şiş həcmi göstərilir.Bu nəticələr göstərir ki, BV2 mənşəli Toksoplazma ilə yoluxmuş ekzosomlar siçan şişi modelində qlioma artımına səbəb olur.
U87 ksenograft siçan modelində BV2-dən alınmış ekzosomların onkogenezi (AC).BV2-dən alınmış RH ilə yoluxmuş ekzosomlarla müalicə olunan BALB/c çılpaq siçanlarda şiş ölçüsü (A) və çəkisi (B) əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır.BALB/c çılpaq siçanlara (C) Matrigel qarışığında dayandırılmış 1 x 107 U87 hüceyrəsi subkutan yolla yeridildi.Enjeksiyondan altı gün sonra siçanlarda 100 μg BV2 törəmə ekzosomları müalicə olundu.Şiş ölçüsü və çəkisi müvafiq olaraq göstərilən günlərdə və qurbandan sonra ölçüldü. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Məlumatlar göstərdi ki, toxunulmazlıq və ya şiş inkişafı ilə əlaqəli 37 miRNA (16 həddindən artıq və 21 aşağı ifadə edilmiş) Toxoplasma RH ştammına yoluxduqdan sonra mikrogliyada əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdi (Şəkil 4A).Dəyişdirilmiş miRNA-lar arasında miR-21-in nisbi ifadə səviyyələri BV2-dən alınan ekzosomlarda, BV2 və U87 hüceyrələri ilə müalicə olunan ekzosomlarda real vaxt rejimində RT-PCR ilə təsdiq edilmişdir.miR-21 ifadəsi Toxoplasma gondii (RH ştammı) ilə yoluxmuş BV2 hüceyrələrindən olan ekzosomlarda əhəmiyyətli artım göstərdi (Şəkil 4B).BV2 və U87 hüceyrələrində miR-21-in nisbi ifadə səviyyələri dəyişdirilmiş ekzosomların qəbulundan sonra artmışdır (Şəkil 4B).Toxoplasma gondii (ME49 ştammı) ilə yoluxmuş şiş xəstələrinin və siçanların beyin toxumalarında miR-21 ifadəsinin nisbi səviyyələri müvafiq olaraq nəzarət qruplarından daha yüksək olmuşdur (Şəkil 4C).Bu nəticələr proqnozlaşdırılan və təsdiqlənmiş mikroRNT-lərin in vitro və in vivo ifadə səviyyələri arasındakı fərqlərlə əlaqələndirilir.
Toxoplasma gondii (RH) ilə yoluxmuş mikroglialarda ekzosomal miP-21a-5p ifadəsində dəyişikliklər.(A) T. gondii RH infeksiyasından sonra toxunulmazlıq və ya şiş inkişafı ilə əlaqəli siRNA-da əhəmiyyətli dəyişiklikləri nümayiş etdirir.(B) Nisbi miR-21 ifadə səviyyələri real vaxt rejimində RT-PCR ilə BV2 törəmə ekzosomlarda, BV2 ilə müalicə olunan ekzosomlarda və U87 hüceyrələrində aşkar edilmişdir.(C) Toxoplasma gondii (ME49 ştammı) ilə yoluxmuş şiş xəstələrinin (N=3) və siçanların beyin toxumalarında nisbi miR-21 ifadə səviyyələri aşkar edilmişdir (N=3). *P < 0.05 Student's t testi ilə əldə edilmişdir. *P < 0.05 Student's t testi ilə əldə edilmişdir. *P < 0,05 kifayət qədər yüksək səviyyədədir. *P <0.05 Student's t-testindən istifadə etməklə əldə edilmişdir. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, t-kriteriya styudenta pomoщью. * P < 0.05 Tələbənin t-testindən istifadə etməklə əldə edilmişdir.
RH ilə yoluxmuş BV2 hüceyrələrindən olan ekzosomlar in vivo və in vitro qliomaların böyüməsinə səbəb oldu (Şəkil 2, 3).Müvafiq mRNA-ları aşkar etmək üçün BV2 və ya RH BV2-dən əldə edilən ekzosomlarla yoluxmuş U87 hüceyrələrində antitümör hədəf genlərinin, çəngəl qutusu O1 (FoxO1), PTEN və proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümü 4 (PDCD4) mRNA səviyyələrini araşdırdıq.Bioinformatika təhlili göstərdi ki, bir neçə şişlə əlaqəli genlər, o cümlədən FoxO1, PTEN və PDCD4 genləri miR-2121,22 bağlayıcı yerlərə malikdir.Antitümör hədəf genlərinin mRNA səviyyələri, BV2 törəmə ekzosomlarla müqayisədə RH ilə yoluxmuş BV2 törəmə ekzosomlarda azalmışdır (Şəkil 5A).FoxO1 RH ilə yoluxmuş BV2 törəmə ekzosomlarda BV2 törəmə ekzosomlarla müqayisədə protein səviyyələrinin azaldığını göstərdi (Şəkil 5B).Bu nəticələrə əsasən, RH ilə yoluxmuş BV2-dən əldə edilən ekzosomların şiş böyüməsindəki rolunu qoruyaraq anti-onkogen genləri aşağı saldığını təsdiq edə bilərik.
Toksoplazma RH ilə yoluxmuş BV2 mənşəli ekzosomlar U87 glioma hüceyrələrində antitümör genlərinin Toksoplazma RH ilə yoluxmuş BV2 törəmə ekzosomları tərəfindən bastırılmasına səbəb olur.(A) PBS ekzosomları ilə müqayisədə T. gondii RH ilə yoluxmuş BV2-dən alınmış ekzosomlarda FoxO1, PTEN və PDCD4 ifadəsinin real vaxtda PCR.Nəzarət kimi β-aktin mRNT istifadə edilmişdir.(B) FoxO1 ifadəsi Western blotlama ilə müəyyən edildi və densitometry məlumatları ImageJ proqramı ilə statistik olaraq qiymətləndirildi. *P < 0.05 Student's t testi ilə əldə edilmişdir. *P < 0.05 Student's t testi ilə əldə edilmişdir. *P < 0,05 kifayət qədər yüksək səviyyədədir. *P <0.05 Student's t-testindən istifadə etməklə əldə edilmişdir. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, t-kriteriya styudenta pomoщью. * P < 0.05 Tələbənin t-testindən istifadə etməklə əldə edilmişdir.
Ekzosomlarda miP-21-in şişlə əlaqəli gen tənzimlənməsinə təsirini anlamaq üçün U87 hüceyrələri Lipofektamin 2000 istifadə edərək miP-21 inhibitoru ilə transfeksiya edildi və hüceyrələr transfeksiyadan 24 saat sonra yığıldı.miR-21 inhibitorları ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələrdə FoxO1 və p27 ifadə səviyyələri qRT-PCR istifadə edərək BV2-dən alınmış ekzosomlarla müalicə olunan hüceyrələrlə müqayisə edilmişdir (Şəkil 6A,B).miR-21 inhibitorunun U87 hüceyrələrinə köçürülməsi FoxO1 və p27 ifadəsini əhəmiyyətli dərəcədə aşağı saldı (Şəkil 6).
RH ilə yoluxmuş ekzosomal BV2-dən əldə edilən miP-21, U87 glioma hüceyrələrində FoxO1/p27 ifadəsini dəyişdirdi.U87 hüceyrələri Lipofektamin 2000 istifadə edərək miP-21 inhibitoru ilə transfeksiya edildi və hüceyrələr transfeksiyadan 24 saat sonra yığıldı.miR-21 inhibitorları ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələrdə FoxO1 və p27 ifadə səviyyələri qRT-PCR (A, B) istifadə edərək BV2-dən alınmış ekzosomlarla müalicə olunan hüceyrələrdəki səviyyələrlə müqayisə edilmişdir.
Ev sahibinin immun reaksiyasından qaçmaq üçün Toxoplasma paraziti toxuma kistinə çevrilir.Onlar ev sahibinin həyatı boyu beyin, ürək və skelet əzələsi də daxil olmaqla müxtəlif toxumalarda parazitlik edir və ev sahibinin immun reaksiyasını modulyasiya edir.Bundan əlavə, onlar ev sahibi hüceyrələrin hüceyrə dövrünü və apoptozunu tənzimləyə, onların yayılmasını təşviq edə bilərlər14,24.Toxoplasma gondii əsasən ev sahibi dendritik hüceyrələri, neytrofilləri və beyin mikroqliyaları da daxil olmaqla monosit/makrofaq nəslini yoluxdurur.Toxoplasma gondii M2 fenotipinin makrofaqlarının diferensiallaşmasına səbəb olur, patogen infeksiyadan sonra yaraların sağalmasına təsir göstərir, həmçinin hipervaskulyarizasiya və qranulomatoz fibrozla əlaqələndirilir.Toksoplazma infeksiyasının bu davranış patogenezi şiş inkişafı ilə əlaqəli markerlərlə əlaqəli ola bilər.Toksoplazma tərəfindən tənzimlənən düşmən mühit müvafiq xərçəng xəstəliyinə bənzəyir.Buna görə də, Toksoplazma infeksiyasının beyin şişlərinin inkişafına kömək etməsi lazım olduğunu güman etmək olar.Əslində, müxtəlif beyin şişləri olan xəstələrin zərdabında Toksoplazma infeksiyasının yüksək göstəriciləri qeyd edilmişdir.Bundan əlavə, Toxoplasma gondii başqa bir kanserogen effektor ola bilər və digər yoluxucu kanserogenlərin beyin şişlərinin inkişafına kömək etmək üçün sinergik şəkildə hərəkət edə bilər.Bu baxımdan, P. falciparum və Epstein-Barr virusunun sinergik olaraq Burkitt lenfomasının meydana gəlməsinə töhfə verdiyini qeyd etmək lazımdır.
Xərçəng tədqiqatı sahəsində tənzimləyici kimi ekzosomların rolu geniş şəkildə araşdırılmışdır.Bununla belə, parazitlər və yoluxmuş sahiblər arasında ekzosomların rolu hələ də zəif başa düşülür.İndiyə qədər müxtəlif tənzimləyicilər, o cümlədən ifraz olunan zülallar, protozoa parazitlərinin ev sahibi hücumuna müqavimət göstərdiyi və infeksiyanı davam etdirdiyi bioloji prosesləri izah etdi.Bu yaxınlarda protozoa ilə əlaqəli mikroveziküllər və onların mikroRNT-lərinin yaşaması üçün əlverişli mühit yaratmaq üçün ana hüceyrələrlə qarşılıqlı əlaqədə olması haqqında artan bir konsepsiya var.Buna görə də, dəyişdirilmiş ekzosomal miRNA-lar və glioma hüceyrələrinin yayılması arasında əlaqəni aşkar etmək üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var.MikroRNT dəyişikliyi (klaster genləri miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 və miR-17-92) toksoplazma ilə yoluxmuş insan makrofaqlarında STAT3 promotoruna bağlanır, tənzimlənir və antiinduksiyaya səbəb olur. -Toxoplasma gondii infeksiyasına cavab olaraq apoptoz 29 .Toksoplazma infeksiyası bir neçə hiperproliferativ xəstəliklərlə əlaqəli olan miR-17-5p və miR-106b-5p ifadəsini artırır 30 .Bu məlumatlar göstərir ki, Toksoplazma infeksiyası ilə tənzimlənən host miRNA-ları ev sahibinin bioloji davranışında parazitlərin sağ qalması və patogenez üçün vacib molekullardır.
Dəyişdirilmiş miRNA-lar bədxassəli hüceyrələrin, o cümlədən qliomaların başlaması və inkişafı zamanı müxtəlif davranış növlərinə təsir göstərə bilər: böyümə siqnallarının özünü təmin etməsi, böyüməni maneə törədən siqnallara həssaslıq, apoptozdan yayınma, qeyri-məhdud replikativ potensial, angiogenez, işğal və metastaz və iltihab.Qliomada dəyişdirilmiş miRNA-lar bir neçə ekspressiv profilləşdirmə tədqiqatlarında müəyyən edilmişdir.
Bu tədqiqatda toksoplazma ilə yoluxmuş ana hüceyrələrdə miRNA-21 ifadəsinin yüksək səviyyədə olduğunu təsdiqlədik.miR-21 bərk şişlərdə, o cümlədən qliomalarda, 33-də ən tez-tez həddindən artıq ifadə edilən mikroRNT-lərdən biri kimi müəyyən edilmişdir və onun ifadəsi qlioma dərəcəsi ilə əlaqələndirilir.Yığılan dəlillər göstərir ki, miR-21 qlioma artımında antiapoptotik amil kimi çıxış edən və insan beyninin bədxassəli xəstəliklərinin toxumalarında və plazmasında yüksək dərəcədə ifrat şəkildə ifadə olunan yeni onkogendir.Maraqlıdır ki, glioma hüceyrələrində və toxumalarında miR-21 inaktivasiyası kaspazadan asılı apoptoza görə hüceyrə proliferasiyasının inhibəsini tetikler.miR-21-in proqnozlaşdırılan hədəflərinin bioinformatik təhlili apoptoz yolları ilə əlaqəli çoxsaylı şiş bastırıcı genləri, o cümlədən proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümü 4 (PDCD4), tropomiozin (TPM1), PTEN və miR-2121 bağlanma yeri ilə çəngəl qutusu O1 (FoxO1) aşkar etdi..22.38.
FoxO1, transkripsiya faktorlarından (FoxO) biri olaraq, insan xərçənginin müxtəlif növlərinin inkişafında iştirak edir və p21, p27, Bim və FasL40 kimi şiş bastırıcı genlərin ifadəsini tənzimləyə bilər.FoxO1 hüceyrə böyüməsini boğmaq üçün p27 kimi hüceyrə dövrü inhibitorlarını bağlaya və aktivləşdirə bilər.Bundan əlavə, FoxO1 PI3K/Akt siqnalının əsas effektorudur və p2742 transkripsiyasının aktivləşdirilməsi yolu ilə hüceyrə dövrünün irəliləməsi və hüceyrə differensasiyası kimi bir çox bioloji prosesləri tənzimləyir.
Yekun olaraq, biz inanırıq ki, Toxoplasma ilə yoluxmuş mikrogliadan əldə edilən ekzosomal miR-21 glioma hüceyrələrinin böyümə tənzimləyicisi kimi mühüm rol oynaya bilər (Şəkil 7).Bununla belə, ekzosomal miR-21, dəyişmiş Toksoplazma infeksiyası və glioma artımı arasında birbaşa əlaqə tapmaq üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var.Bu nəticələrin Toksoplazma infeksiyası ilə glioma tezliyi arasındakı əlaqəni öyrənmək üçün başlanğıc nöqtəsi olacağı gözlənilir.
Bu işdə glioma (beyin) kanserogenez mexanizminin sxematik diaqramı təklif edilmişdir.Müəllif PowerPoint 2019-da (Microsoft, Redmond, WA) çəkir.
Heyvanların istifadəsi də daxil olmaqla bu tədqiqatda bütün eksperimental protokollar Seul Milli Universitetinin Heyvanlara Qulluq və İstifadəçi Komitəsinin Standart Etik Təlimatlarına uyğun idi və Seul Milli Universiteti Tibb Məktəbinin İnstitusional Nəzarət Şurası tərəfindən təsdiq edilmişdir (IRB nömrəsi SNU- 150715).-2).Bütün eksperimental prosedurlar ARRIVE tövsiyələrinə uyğun olaraq həyata keçirilmişdir.
BV2 siçan mikroqliyası və U87 insan glioma hüceyrələri müvafiq olaraq Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seul, Koreya) və Roswell Park Memorial Institute's Medium'da (RPMI; Welgene), hər birində 10% fetal iribuynuzlu zərdabda, 4 mMl-də becərildi. glutamin, 0,2 mM penisilin və 0,05 mM streptomisin.Hüceyrələr 37°C-də 5% CO2 ilə inkubatorda becərildi.Digər glioma hüceyrə xətti, U118, U87 hüceyrələri ilə müqayisə üçün istifadə edilmişdir.
T. gondii ilə yoluxmuş RH və ME49 ştammlarından ekzosomları təcrid etmək üçün 3-4 gün əvvəl inyeksiya edilmiş 6 həftəlik BALB/c siçanlarının qarın boşluğundan T. gondii tachyzoites (RH ştammı) yığılmışdır.Taxizoitlər üç dəfə PBS ilə yuyuldu və 40% Perkolda (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABŞ)43 sentrifuqa ilə təmizləndi.ME49 ştamının taxizoitlərini əldə etmək üçün BALB/c siçanlarına 20 toxuma kistası intraperitoneal yeridilmiş və infeksiyadan (PI) sonra 6-8-ci gündə qarın boşluğunun yuyulması yolu ilə kistalarda taxizoit transformasiyası toplanmışdır.PBS ilə yoluxmuş siçanlar.ME49 taxizoitləri 100 μg/ml penisilin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, ABŞ), 100 μg/ml streptomisin (Gibco/BRL) və 5% fetal iribuynuzlu heyvan serumu (Lonza, Walkersville, MD) ilə əlavə edilmiş hüceyrələrdə yetişdirildi. .., ABŞ) 37 °C və 5% karbon qazı.Vero hüceyrələrində becərildikdən sonra, ME49 taxizoitləri zibil və hüceyrələri təmizləmək üçün iki dəfə 25 kalibrli iynədən, sonra isə 5 mikron filtrdən keçirildi.Yuyulduqdan sonra taxizoitlər PBS44-də yenidən dayandırıldı.Toxoplasma gondii ME49 ştammının toxuma kistləri yoluxmuş C57BL/6 siçanlarının (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Koreya) beynindən təcrid olunmuş kistlərin peritondaxili yeridilməsi ilə saxlanılmışdır.ME49-a yoluxmuş siçanların beyinləri 3 aylıq PI-dan sonra yığılıb və kistləri təcrid etmək üçün mikroskop altında doğranıb.Yoluxmuş siçanlar Seul Milli Universitetinin Tibb Məktəbində xüsusi patogensiz şəraitdə (SPF) saxlanılıb.
İstehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq miRNeasy Mini Kitdən (Qiagen, Hilden, Almaniya) istifadə edərək, BV2-dən alınmış ekzosomlardan, BV2 hüceyrələrindən və toxumalarından ümumi RNT çıxarılıb, o cümlədən elüsyon mərhələsi üçün inkubasiya vaxtı.RNT konsentrasiyası NanoDrop 2000 spektrofotometrində müəyyən edilmişdir.RNT mikroarraylarının keyfiyyəti Agilent 2100 bioanalizatorundan (Agilent Technologies, Amstelveen, Hollandiya) istifadə edilməklə qiymətləndirilib.
10% ekzozomu zəif FBS ilə DMEM 4°C-də 16 saat ərzində 100,000 q-da ultrasentrifuqa ilə hazırlanmış və 0,22 µm filtrdən (Nalgene, Rochester, NY, ABŞ) süzülmüşdür.BV2 hüceyrələri, 5 × 105, 37 ° C və 5% CO2-də 10% ekzosom tükənmiş FBS və 1% antibiotikdən ibarət DMEM-də becərildi.24 saatlıq inkubasiyadan sonra hüceyrələrə RH və ya ME49 (MOI = 10) ştammının taxizoitləri əlavə edildi və bir saat ərzində invaziv olmayan parazitlər çıxarıldı və yenidən DMEM ilə dolduruldu.BV2 hüceyrələrindən ekzosomlar ən çox istifadə edilən üsul olan dəyişdirilmiş diferensial sentrifuqasiya ilə təcrid edilmişdir.RNT və ya zülal analizi üçün 300 µl PBS-də ekzosom pelletini yenidən dayandırın.Təcrid olunmuş ekzosomların konsentrasiyası BCA protein analiz dəsti (Pierce, Rockford, IL, ABŞ) və NanoDrop 2000 spektrofotometrindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir.
BV2 hüceyrələrindən və ya BV2-dən əldə edilən ekzosomlardan çöküntülər PRO-PREP™ protein ekstraksiya məhlulunda (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Koreya) parçalandı və zülallar Coomassie parlaq mavi rəngə boyanmış 10% SDS poliakrilamid gellərinə yükləndi.Bundan əlavə, zülallar 2 saat ərzində PVDF membranlarına köçürüldü.Qərb ləkələri ekzosomal marker kimi Alix antikorundan (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ABŞ) istifadə edilərək təsdiq edilmişdir.HRP ilə birləşdirilmiş keçi anti-siçan IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, ABŞ) və LAS-1000 plus luminescent təsvir analizatoru (Fuji Photographic Film, Tokio, Yaponiya) ikinci dərəcəli antikor kimi istifadə edilmişdir..Ekzosomların ölçüsünü və morfologiyasını öyrənmək üçün transmissiya elektron mikroskopiyası aparılmışdır.BV2 hüceyrələrindən təcrid olunmuş ekzosomlar (6.40 µg/µl) karbonla örtülmüş torlarda hazırlanmış və 1 dəqiqə ərzində 2% uranil asetat ilə mənfi şəkildə boyanmışdır.Hazırlanmış nümunələr ES1000W Erlangshen CCD kamerası (Gatan, Pleasanton, CA, ABŞ) ilə təchiz olunmuş JEOL 1200-EX II (Tokio, Yaponiya) vasitəsilə 80 kV-lik sürətləndirici gərginlikdə müşahidə edilmişdir.
BV2-dən alınan ekzosomlar otaq temperaturunda 15 dəqiqə ərzində PKH26 Qırmızı Flüoresan Bağlayıcı Kitdən (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) istifadə edilərək boyanmışdır.PKH26 etiketli ekzosomları (qırmızı) olan və ya mənfi nəzarət kimi heç bir ekzosom olmayan 2×105 U87 hüceyrələri 5% CO2 inkubatorunda 24 saat ərzində 37°C-də inkubasiya edildi.U87 hüceyrə nüvələri DAPI (mavi) ilə boyandı, U87 hüceyrələri 4°C-də 15 dəqiqə ərzində 4% paraformaldehiddə fiksasiya olundu və sonra Leica TCS SP8 STED CW konfokal mikroskop sistemində (Leica Microsystems, Mannheim, Almaniya) təhlil edildi.müşahidə oluna bilən.
cDNA Mir-X siRNA birinci zəncir sintezi və SYBR qRT-PCR dəsti (Takara Bio Inc., Shiga, Yaponiya) istifadə edərək siRNA-dan sintez edilmişdir.Real vaxt kəmiyyəti PCR SYBR Premix ilə qarışdırılmış primerlər və şablonlardan istifadə etməklə iQ5 real vaxt PCR aşkarlama sistemindən (Bio-Rad, Hercules, CA, ABŞ) istifadə edərək həyata keçirilmişdir.DNT 40 denatürasiya dövrü üçün 95°C-də 15 s və 60°C-də 60 s müddətində tavlanma üçün gücləndirilmişdir.Hər bir PCR reaksiyasından əldə edilən məlumatlar iQ™5 optik sistem proqramının (Bio-Rad) məlumat təhlili modulundan istifadə etməklə təhlil edilmişdir.Seçilmiş hədəf genlər və β-aktin/siRNA (və U6) arasında gen ifadəsində nisbi dəyişikliklər standart əyri metodu ilə hesablanmışdır.İstifadə olunan primer ardıcıllığı Cədvəl 1-də göstərilmişdir.
3 x 104 U87 qlioma hüceyrəsi 96 quyu boşqablara əkilmiş və 12, 18 və 36 saatlarda nəzarət kimi BV2 (50 μq/mL) və ya BV2-dən (50 μq/mL) əldə edilən Toksoplazma ilə yoluxmuş ekzosomlarla qarışdırılmışdır. .Hüceyrələrin çoxalma sürəti Hüceyrə Sayma Kiti-8 (Dojindo, Kumamoto, Yaponiya) (Əlavə Şəkillər S1-S3) 46 istifadə edərək müəyyən edilmişdir.
5 həftəlik dişi BALB/c çılpaq siçanlar Orient Biodan (Seongnam-si, Cənubi Koreya) alınmış və ayrı-ayrılıqda otaq temperaturunda (22±2°C) və rütubətdə (45±15°C) steril qəfəslərdə saxlanılmışdır.%) otaq temperaturunda (22±2°C) və rütubətdə (45±15%).SPF (Seul Milli Universiteti Tibb Fakültəsi Heyvan Mərkəzi) altında 12 saatlıq işıq dövrü və 12 saatlıq qaranlıq dövrü həyata keçirilib.Siçanlar təsadüfi olaraq hər biri 5 siçan olmaqla üç qrupa bölündü və bütün qruplara 1 x 107 U87 glioma hüceyrəsi və azaldılmış BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, ABŞ) olan 400 ml PBS ilə dərialtı yeridildi.Şiş inyeksiyasından altı gün sonra BV2 hüceyrələrindən (Toksoplazma infeksiyası olan/olmadan) əldə edilən 200 mq ekzosom şiş sahəsinə yeridildi.Şiş infeksiyasından iyirmi iki gün sonra, hər qrupdakı siçanların şiş ölçüsü həftədə üç dəfə kaliperlə ölçüldü və şişin həcmi düsturla hesablandı: 0,5 × (en) × 2 × uzunluq.
miRCURYTM LNA miRNA massivindən istifadə edərək MicroRNA ifadə analizi, 7-ci nəsil mmu və rno massivlərinə malikdir (EXIQON, Vedbaek, Danimarka) 3100 insan, siçan və siçovul miRNA ələ keçirmə zondları arasında 1119 yaxşı xarakterizə edilmiş siçanı əhatə edir.Bu prosedur zamanı 250-dən 1000 ng-a qədər ümumi RNT 5′-fosfatdan dana bağırsağının qələvi fosfatazası ilə müalicə olunduqdan sonra Hy3 yaşıl flüoresan boya ilə etiketlənərək çıxarıldı.Etiketlənmiş nümunələr daha sonra hibridləşdirmə kamerası dəsti (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABŞ) və hibridləşdirmə slayd dəsti (Agilent Technologies) istifadə edərək mikroarray slaydlarını yükləməklə hibridləşdirildi.Hibridləşmə 16 saat ərzində 56°C-də aparıldı, sonra mikroarraylar istehsalçının tövsiyələrinə uyğun olaraq yuyuldu.İşlənmiş mikroarray slaydları daha sonra Agilent G2565CA mikroarray skaner sistemindən (Agilent Technologies) istifadə edərək skan edildi.Skan edilmiş şəkillər Agilent Feature Extraction proqram təminatının 10.7.3.1 (Agilent Technologies) versiyasından istifadə etməklə idxal edilib və hər bir təsvirin flüoresans intensivliyi dəyişdirilmiş Exiqon protokolunun müvafiq GAL faylından istifadə etməklə ölçüldü.Cari tədqiqat üçün mikroarray məlumatları GPL32397 giriş nömrəsi ilə GEO verilənlər bazasında saxlanılır.
Toksoplazma ilə yoluxmuş RH və ya ME49 suşlarının mikroglialarında yetkin ekzosomal miRNA-ların ifadə profilləri müxtəlif şəbəkə alətlərindən istifadə etməklə təhlil edilmişdir.Şiş inkişafı ilə əlaqəli miRNA-lar miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) istifadə edərək müəyyən edildi və normallaşdırılmış siqnal intensivliyi (log2) ilə 8.0-dən çox süzüldü.miRNA-lar arasında diferensial şəkildə ifadə edilmiş miRNA-ların T. gondii ilə yoluxmuş RH və ya ME49 ştammları ilə dəyişdirilmiş miRNA-ların filtr analizi ilə 1,5 dəfədən çox dəyişdiyi aşkar edilmişdir.
Hüceyrələr Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABŞ) istifadə edərək opti-MEM-də (Gibco, Carlsbad, CA, ABŞ) altı quyu boşqablara (3 x 105 hüceyrə/quyu) əkilmişdir.Transfeksiya edilmiş hüceyrələr 6 saat ərzində kultura edildi və sonra mühit təzə tam mühitə dəyişdirildi.Hüceyrələr transfeksiyadan 24 saat sonra yığılmışdır.
Statistik təhlil əsasən Excel proqramı ilə (Microsoft, Vaşinqton, DC, ABŞ) Student's t-testindən istifadə etməklə aparılmışdır.Eksperimental heyvan analizi üçün Prism 3.0 proqram təminatından (GraphPad Software, La Jolla, CA, ABŞ) istifadə etməklə ikitərəfli ANOVA aparılmışdır. P-dəyərləri < 0,05 statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir. P-dəyərləri < 0,05 statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir. Значения P <0,05 статистические значими. P <0.05 dəyərləri statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 статистические значими. P <0.05 dəyərləri statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir.
Bu tədqiqatda istifadə edilən bütün eksperimental protokollar Seul Milli Universiteti Tibb Məktəbinin İnstitusional Nəzarət Şurası (IRB nömrəsi SNU-150715-2) tərəfindən təsdiq edilmişdir.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.2018-ci ildə təxmin edilən qlobal xərçəng insidansı və ölüm: GLOBOCAN mənbələri və üsulları.Təfsir.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Beyin şişlərinin risk faktorları və onların terapevtik müdaxilələri haqqında bir fikir. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Beyin şişlərinin risk faktorları və onların terapevtik müdaxilələri haqqında bir fikir.Rəşid, S., Rehman, K. və Akash, MS. Beyin şişləri və əsas terapevtik müdaxilələr üçün risk faktorlarının nəzərdən keçirilməsi. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Beyin şişi risk faktorları və terapevtik müdaxilələr haqqında dərin anlayış.Rəşid, S., Rehman, K. və Akash, MS. Beyin şişləri və əsas terapevtik müdaxilələr üçün risk faktorlarının nəzərdən keçirilməsi.Biotibbi elm.Əczaçı.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan ağız-həzm və qadın cinsiyyət orqanlarının xərçənglərində bakterial-viral qarşılıqlı əlaqə: Epidemioloji və laboratoriya sübutlarının xülasəsi. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan ağız-həzm və qadın cinsiyyət orqanlarının xərçənglərində bakterial-viral qarşılıqlı əlaqə: Epidemioloji və laboratoriya sübutlarının xülasəsi.Kato I., Zhang J. və Sun J. İnsan mədə-bağırsaq traktının və qadın cinsiyyət orqanlarının xərçəngində bakterial-viral qarşılıqlı əlaqə: epidemioloji və laboratoriya məlumatlarının xülasəsi. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用：北毒相互作用：北毒相互作用：据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. İnsan ağız boşluğunun həzmində və qadın reproduktiv sistemində bakterio-viral qarşılıqlı əlaqə: məşhur xəstəlik elminin və laboratoriya sübutlarının xülasəsi.Kato I., Zhang J. və Sun J. İnsan mədə-bağırsaq xərçəngi və qadın genital xərçəngində bakterial-viral qarşılıqlı əlaqə: epidemioloji və laboratoriya məlumatlarının xülasəsi.Xərçəng 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL İnfeksiyadan xərçəngə: DNT şiş virusları ev sahibi hüceyrə mərkəzi karbon və lipid metabolizmasını necə dəyişdirir. Magon, KL & Parish, JL İnfeksiyadan xərçəngə: DNT şiş virusları ev sahibi hüceyrə mərkəzi karbon və lipid metabolizmasını necə dəyişdirir.Mahon, KL və Parish, JL Xərçəng üçün yanğın infeksiyası: DNT əsaslı şiş virusları ev sahibi hüceyrə mərkəzi karbon və lipid metabolizmasını necə dəyişdirir. Magon, KL & Parish, JL. Magon, KL & Parish, JL İnfeksiyadan xərçəngə: DNT şiş virusları ev sahibi hüceyrə mərkəzi karbon və lipid metabolizmasını necə dəyişdirir.Mahon, KL və Parish, JL Xərçəng infeksiyasını söndürür: DNT şiş virusları ev sahibi hüceyrələrdə mərkəzi karbon və lipid mübadiləsini necə dəyişdirir.Açıq Biologiya.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Şistosomların katexol estrogenləri və qaraciyər qanaxmaları və helmintlərlə əlaqəli xərçəng.ön.içi isti.5, 444 (2014).