Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan təqdim edəcəyik.
Ağciyər kistik fibrozunun müalicəsi üçün gen vektorları keçirici tənəffüs yollarına yönəldilməlidir, çünki periferik ağciyər transduksiyasının terapevtik təsiri yoxdur.Viral ötürülmənin effektivliyi birbaşa daşıyıcının qalma müddətindən asılıdır.Bununla belə, gen daşıyıcıları kimi çatdırılma mayeləri inhalyasiya zamanı təbii olaraq alveolalara yayılır və istənilən formalı terapevtik hissəciklər mukosiliar daşınma ilə sürətlə çıxarılır.Gen daşıyıcılarının tənəffüs yollarında qalma müddətinin uzadılması vacibdir, lakin buna nail olmaq çətindir.Tənəffüs yollarının səthinə yönəldilə bilən daşıyıcı ilə birləşmiş maqnit hissəcikləri regional hədəflənməni yaxşılaşdıra bilər.In vivo görüntüləmə ilə bağlı problemlərə görə, tətbiq olunan maqnit sahəsinin mövcudluğunda belə kiçik maqnit hissəciklərinin tənəffüs yollarının səthindəki davranışı zəif başa düşülür.Bu tədqiqatın məqsədi in vivo tək və toplu hissəciklərin dinamikasını və davranış nümunələrini öyrənmək üçün anesteziya edilmiş siçovulların traxeyasında bir sıra maqnit hissəciklərinin hərəkətini in vivo görüntüləmək üçün sinxrotron təsvirindən istifadə etmək idi.Daha sonra lentiviral maqnit hissəciklərinin maqnit sahəsinin mövcudluğunda çatdırılmasının siçovul traxeyasında ötürülmənin effektivliyini artırıb-artırmayacağını da qiymətləndirdik.Sinxrotron rentgenoqrafiyası in vitro və in vivo stasionar və hərəkət edən maqnit sahələrində maqnit hissəciklərinin davranışını göstərir.Hissəcikləri maqnitlərdən istifadə edərək canlı hava yollarının səthi boyunca asanlıqla sürükləmək mümkün deyil, lakin daşınma zamanı çöküntülər maqnit sahəsinin ən güclü olduğu görmə sahəsində cəmləşir.Lentiviral maqnit hissəcikləri bir maqnit sahəsinin mövcudluğunda çatdırıldıqda ötürülmə səmərəliliyi də altı dəfə artdı.Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr lentiviral maqnit hissəciklərinin və maqnit sahələrinin in vivo keçirici hava yollarında gen vektorunun hədəflənməsi və ötürülmə səviyyələrini yaxşılaşdırmaq üçün dəyərli yanaşmalar ola biləcəyini göstərir.
Kistik fibroz (KF), CF transmembran keçiricilik tənzimləyicisi (CFTR) adlanan tək bir gendəki dəyişikliklərdən qaynaqlanır.CFTR proteini, kistik fibrozun patogenezində əsas yer olan tənəffüs yolları da daxil olmaqla, bədənin bir çox epitel hüceyrələrində mövcud olan bir ion kanalıdır.CFTR-dəki qüsurlar anormal su nəqlinə, tənəffüs yollarının səthinin susuzlaşmasına və hava yolu səthi maye təbəqəsinin (ASL) dərinliyinin azalmasına səbəb olur.O, həmçinin mukosiliar nəqliyyat (MCT) sisteminin tənəffüs yollarını inhalyasiya edilmiş hissəciklərdən və patogenlərdən təmizləmək qabiliyyətini zəiflədir.Məqsədimiz CFTR geninin düzgün nüsxəsini çatdırmaq və ASL, MCT və ağciyər sağlamlığını yaxşılaşdırmaq üçün lentiviral (LV) gen terapiyasını inkişaf etdirmək və bu parametrləri in vivo1 ölçə bilən yeni texnologiyaların inkişaf etdirilməsinə davam etməkdir.
LV vektorları kistik fibroz gen terapiyası üçün aparıcı namizədlərdən biridir, çünki onlar terapevtik geni tənəffüs yolunun bazal hüceyrələrinə (tənəffüs yollarının kök hüceyrələri) daimi olaraq inteqrasiya edə bilirlər.Bu vacibdir, çünki onlar kistik fibrozla əlaqəli funksional genlə korreksiya edilmiş tənəffüs yollarının səthi hüceyrələrinə diferensiallaşaraq normal nəmləndirməni və selik klirensini bərpa edə bilir və nəticədə ömür boyu fayda verir.LV vektorları keçirici tənəffüs yollarına qarşı yönəldilməlidir, çünki CF-də ağciyərin tutulması burada başlayır.Vektorun ağciyərə daha dərinə çatdırılması alveolyar transduksiya ilə nəticələnə bilər, lakin bunun kistik fibrozda terapevtik təsiri yoxdur.Bununla belə, gen daşıyıcıları kimi mayelər doğuşdan sonra tənəffüs olunduqda təbii olaraq alveolalara köçür3,4 və müalicəvi hissəciklər MCT-lər tərəfindən sürətlə ağız boşluğuna atılır.LV ötürülməsinin səmərəliliyi birbaşa vektorun hüceyrə qəbuluna imkan vermək üçün hədəf hüceyrələrə yaxın qalma müddəti ilə birbaşa bağlıdır - tipik regional hava axını ilə asanlıqla qısaldılan "yaşayış müddəti" 5, həmçinin selik və MCT hissəciklərinin koordinasiyalı qəbulu.Kistik fibroz üçün, tənəffüs yollarında LV qalma müddətini uzatmaq qabiliyyəti bu sahədə yüksək transduksiya səviyyəsinə nail olmaq üçün vacibdir, lakin indiyə qədər çətin olmuşdur.
Bu maneəni dəf etmək üçün LV maqnit hissəciklərinin (MP) bir-birini tamamlayan iki şəkildə kömək edə biləcəyini təklif edirik.Birincisi, hədəflənməni yaxşılaşdırmaq və gen daşıyıcı hissəciklərin tənəffüs yolunun düzgün bölgəsində olmasına kömək etmək üçün hava yolu səthinə bir maqnitlə istiqamətləndirilə bilər;və ASL) hüceyrə qatına keçir 6. MP-lər antikorlara, kimyaterapiya dərmanlarına və ya hüceyrə membranlarına bağlanan və ya onların müvafiq hüceyrə səthi reseptorlarına bağlanan və şiş yerlərində toplanan digər kiçik molekullara bağlandıqda, hədəflənmiş dərman vasitələri kimi geniş istifadə olunur. statik elektrikin mövcudluğu.Xərçəng müalicəsi üçün maqnit sahələri 7. Digər “hipertermik” üsullar salınan maqnit sahələrinə məruz qaldıqda MP-ləri qızdırmaqla şiş hüceyrələrini öldürməyə yönəldilmişdir.DNT-nin hüceyrələrə ötürülməsini gücləndirmək üçün maqnit sahəsinin transfeksiya agenti kimi istifadə edildiyi maqnit transfeksiya prinsipi, çətin ötürülən hüceyrə xətləri üçün bir sıra qeyri-viral və viral gen vektorlarından istifadə etməklə in vitroda adətən istifadə olunur. ..Statik maqnit sahəsinin mövcudluğunda LV MP-nin insan bronxial epitelinin hüceyrə xəttinə in vitro çatdırılması ilə LV magnetotransfeksiyasının səmərəliliyi müəyyən edilmişdir ki, bu da tək LV vektoru ilə müqayisədə ötürülmənin səmərəliliyini 186 dəfə artırmışdır.LV MT həmçinin kistik fibrozun in vitro modelinə tətbiq edilmişdir, burada maqnit transfeksiyası kistik fibroz bəlğəminin mövcudluğu ilə hava-maye interfeys mədəniyyətlərində LV transduksiyasını 20 dəfə artırmışdır10.Bununla belə, in vivo orqan maqnitotransfeksiyasına nisbətən az diqqət yetirilmişdir və yalnız bir neçə heyvan tədqiqatında11,12,13,14,15, xüsusən də ağciyərlərdə16,17 qiymətləndirilmişdir.Bununla belə, kistik fibrozda ağciyər terapiyasında maqnit transfeksiyasının imkanları aydındır.Tan və başqaları.(2020) bildirdi ki, “maqnit nanohissəciklərinin ağciyərlərə effektiv çatdırılması üzrə qiymətləndirmə tədqiqatı kistik fibrozlu xəstələrdə klinik nəticələri yaxşılaşdırmaq üçün gələcək CFTR inhalyasiya strategiyalarına yol açacaq”6.
Tətbiq olunan maqnit sahəsinin mövcudluğunda tənəffüs yollarının səthində kiçik maqnit hissəciklərinin davranışını vizuallaşdırmaq və öyrənmək çətindir və buna görə də onlar zəif başa düşülür.Digər tədqiqatlarda biz qaz kanalının səthinin nəmləndirilməsini birbaşa ölçmək üçün ASL18 dərinliyində və MCT19 davranışında20 dəqiqə in vivo dəyişikliklərin qeyri-invaziv görüntülənməsi və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün Sinxrotron Yayılma Əsaslı Faza Kontrast X-Ray Təsviri (PB-PCXI) metodunu işləyib hazırlamışıq. və müalicənin effektivliyinin erkən göstəricisi kimi istifadə olunur.Bundan əlavə, MCT qiymətləndirmə metodumuz PB-PCXI21 ilə görünən MCT markerləri kimi alüminium oksidindən və ya yüksək sındırma indeksli şüşədən ibarət 10-35 µm diametrli hissəciklərdən istifadə edir.Hər iki üsul millət vəkilləri də daxil olmaqla bir sıra hissəcik növlərinin təsviri üçün uyğundur.
Yüksək məkan və zaman ayırdetmə qabiliyyətinə görə, bizim PB-PCXI əsaslı ASL və MCT analizlərimiz MP geninin çatdırılma üsullarını başa düşmək və optimallaşdırmaq üçün in vivo tək və toplu hissəciklərin dinamikasını və davranış nümunələrini öyrənmək üçün çox uyğundur.Burada istifadə etdiyimiz yanaşma SPring-8 BL20B2 şüa xəttindən istifadə etməklə apardığımız araşdırmalara əsaslanır, burada müşahidə olunan heterojen gen ifadə nümunələrini izah etməyə kömək etmək üçün siçanların burun və ağciyər tənəffüs yollarına dummy vektor dozasının verilməsindən sonra mayenin hərəkətini görüntüləmişik. bizim genimizdə.3.4 daşıyıcı doza ilə heyvan tədqiqatları.
Bu tədqiqatın məqsədi canlı siçovulların traxeyasında bir sıra millət vəkillərinin in vivo hərəkətlərini vizuallaşdırmaq üçün PB-PCXI sinxrotronundan istifadə etmək idi.Bu PB-PCXI görüntüləmə tədqiqatları MP seriyasını, maqnit sahəsinin gücünü və MP hərəkətinə təsirini müəyyən etmək üçün yeri yoxlamaq üçün nəzərdə tutulmuşdur.Biz güman etdik ki, xarici maqnit sahəsi çatdırılan MF-nin qalmasına və ya hədəf əraziyə keçməsinə kömək edəcək.Bu tədqiqatlar həmçinin çökmədən sonra traxeyada qalan hissəciklərin miqdarını maksimuma çatdıran maqnit konfiqurasiyalarını müəyyən etməyə imkan verdi.Tədqiqatların ikinci seriyasında biz LV-MP-lərin hava yollarının hədəflənməsi kontekstində çatdırılmasının nəticələnəcəyini ehtimal edərək, LV-MP-lərin siçovulların hava yollarına in vivo çatdırılması nəticəsində yaranan transduksiya modelini nümayiş etdirmək üçün bu optimal konfiqurasiyadan istifadə etməyi hədəflədik. artan LV transduksiya səmərəliliyində..
Bütün heyvan tədqiqatları Adelaide Universiteti (M-2019-060 və M-2020-022) və SPring-8 Sinxrotron Heyvan Etikası Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmiş protokollara uyğun olaraq aparılmışdır.Təcrübələr ARRIVE şirkətinin tövsiyələrinə uyğun olaraq aparılmışdır.
Bütün rentgen şəkilləri Yaponiyadakı SPring-8 sinxrotronunda BL20XU şüa xəttində, əvvəllər təsvir edilənə bənzər bir quruluşdan istifadə edərək çəkilmişdir21,22.Qısaca olaraq, eksperimental qutu sinxrotron saxlama halqasından 245 m məsafədə yerləşirdi.Faza kontrast effektləri yaratmaq üçün hissəciklərin təsviri tədqiqatları üçün nümunədən detektora 0,6 m, in vivo görüntüləmə tədqiqatları üçün isə 0,3 m məsafədən istifadə olunur.Enerjisi 25 keV olan monoxromatik şüa istifadə edilmişdir.Şəkillər sCMOS detektoruna qoşulmuş yüksək rezolyusiyaya malik X-ray transduserindən (SPring-8 BM3) istifadə edilməklə əldə edilib.Transduser 10 µm qalınlığında sintillyatordan (Gd3Al2Ga3O12) istifadə edərək rentgen şüalarını görünən işığa çevirir, bu da daha sonra ×10 (NA 0.3) mikroskop obyektivindən istifadə edərək sCMOS sensoruna yönəldilir.sCMOS detektoru massiv ölçüsü 2048 × 2048 piksel və xam piksel ölçüsü 6,5 × 6,5 µm olan Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Yaponiya) idi.Bu parametr 0,51 µm effektiv izotrop piksel ölçüsü və təxminən 1,1 mm × 1,1 mm baxış sahəsi verir.Tənəffüs nəticəsində yaranan hərəkət artefaktlarını minimuma endirərkən, tənəffüs yollarının daxilində və xaricində maqnit hissəciklərinin siqnal-küy nisbətini maksimuma çatdırmaq üçün 100 ms-lik məruz qalma müddəti seçilmişdir.İn vivo tədqiqatlar üçün ekspozisiyalar arasında rentgen şüasını bloklamaqla radiasiya dozasını məhdudlaşdırmaq üçün rentgen yoluna sürətli rentgen qapağı yerləşdirildi.
LV mediası heç bir SPring-8 PB-PCXI görüntüləmə tədqiqatlarında istifadə edilməmişdir, çünki BL20XU görüntüləmə kamerası Biotəhlükəsizlik Səviyyəsi 2 sertifikatına malik deyildir.Bunun əvəzinə, biz iki kommersiya istehsalçısından bir sıra ölçüləri, materialları, dəmir konsentrasiyalarını və tətbiqləri əhatə edən bir sıra yaxşı xarakterizə edilmiş millət vəkillərini seçdik - əvvəlcə maqnit sahələrinin şüşə kapilyarlarda MP-lərin hərəkətinə necə təsir etdiyini başa düşmək üçün, sonra isə canlı tənəffüs yolları.səthi.MP-nin ölçüsü 0,25 ilə 18 µm arasında dəyişir və müxtəlif materiallardan hazırlanır (Cədvəl 1-ə baxın), lakin MP-dəki maqnit hissəciklərinin ölçüsü daxil olmaqla hər bir nümunənin tərkibi məlum deyil.Geniş MCT tədqiqatlarımıza əsaslanaraq 19, 20, 21, 23, 24, biz gözləyirik ki, 5 µm-ə qədər olan MP-lər traxeyanın tənəffüs yolunun səthində, məsələn, MP hərəkətinin yaxşılaşmış görünməsini görmək üçün ardıcıl çərçivələri çıxarmaqla görünə bilər.0,25 µm-lik tək MP görüntüləmə cihazının ayırdetmə qabiliyyətindən kiçikdir, lakin PB-PCXI-nin onların həcm kontrastını və çökdürüldükdən sonra çökdürüldükləri səth mayesinin hərəkətini aşkar edəcəyi gözlənilir.
Cədvəldəki hər bir deputat üçün nümunələr.1 daxili diametri 0,63 mm olan 20 μl şüşə kapilyarlarda (Drummond Microcaps, PA, ABŞ) hazırlanmışdır.Korpuskulyar hissəciklər suda, CombiMag hissəcikləri isə istehsalçının xüsusi mayesində mövcuddur.Hər boru yarıya qədər maye ilə doldurulur (təxminən 11 µl) və nümunə tutucuya yerləşdirilir (Şəkil 1-ə baxın).Şüşə kapilyarlar, müvafiq olaraq, görüntüləmə kamerasında səhnəyə üfüqi şəkildə yerləşdirildi və mayenin kənarlarında yerləşdirildi.Nadir torpaq, neodim, dəmir və bordan (NdFeB) (N35, kat. № LM1652, Jaycar Electronics, Avstraliya) hazırlanmış 19 mm diametrli (28 mm uzunluqda) nikel qabığı maqnit 1,17 T remanentliyə malikdir nail olmaq üçün ayrıca köçürmə cədvəli Göstərmə zamanı mövqeyinizi uzaqdan dəyişdirin.X-ray təsviri maqnit nümunədən təxminən 30 mm yuxarı yerləşdirildikdə və şəkillər saniyədə 4 kadr sürətlə əldə edildikdə başlayır.Görüntüləmə zamanı maqnit şüşə kapilyar boruya yaxınlaşdırıldı (təxminən 1 mm məsafədə) və sonra sahə gücünün və mövqeyinin təsirini qiymətləndirmək üçün boru boyunca hərəkət etdi.
Xy nümunəsinin tərcüməsi mərhələsində şüşə kapilyarlarda MP nümunələri olan in vitro görüntüləmə qurğusu.X-şüasının yolu qırmızı nöqtəli xətt ilə qeyd olunur.
Millət vəkillərinin in vitro görünməsi müəyyən edildikdən sonra onların bir hissəsi vəhşi tip dişi Wistar albinos siçovullarında (~12 həftəlik, ~200 q) in vivo sınaqdan keçirildi.Medetomidin 0,24 mq/kq (Domitor®, Zenoaq, Yaponiya), midazolam 3,2 mq/kq (Dormicum®, Astellas Pharma, Yaponiya) və butorfanol 4 mq/kq (Vetorphale®, Meiji Seika).Siçovullar intraperitoneal inyeksiya ilə Pharma (Yaponiya) qarışığı ilə anesteziya edilmişdir.Anesteziyadan sonra onlar nəfəs borusu ətrafındakı xəzləri çıxararaq, endotrakeal boru (ET; 16 Ga venadaxili kanül, Terumo BCT) daxil edərək və içərisində termal çanta olan xüsusi hazırlanmış görüntüləmə lövhəsində uzanmış vəziyyətdə immobilizasiya etməklə görüntüləmə üçün hazırlanmışdılar. bədən istiliyini saxlamaq üçün.22. Daha sonra görüntüləmə lövhəsi Şəkil 2a-da göstərildiyi kimi rentgen şəklinə traxeyanı üfüqi şəkildə uyğunlaşdırmaq üçün görüntüləmə qutusundakı nümunə mərhələsinə bir az bucaqla əlavə edildi.
(a) SPring-8 görüntüləmə qurğusunda in vivo təsvirin qurulması, qırmızı nöqtəli xətt ilə işarələnmiş rentgen şüası yolu.(b,c) Trakeal maqnit lokalizasiyası iki ortoqonal quraşdırılmış IP kameradan istifadə edərək uzaqdan həyata keçirildi.Ekrandakı görüntünün sol tərəfində başlığı tutan məftil halqasını və ET borusunun içərisində quraşdırılmış çatdırılma kanülünü görə bilərsiniz.
100 µl şüşə şprisdən istifadə edən uzaqdan idarə olunan şpris nasos sistemi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 30 Ga iynə ilə PE10 borusuna (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) qoşuldu.Endotraxeal borunu daxil edərkən ucun nəfəs borusunda düzgün vəziyyətdə olmasını təmin etmək üçün borunu qeyd edin.Mikronasosdan istifadə edərək şprisin pistonu çıxarıldı və borunun ucu çatdırılacaq MP nümunəsinə batırıldı.Yüklənmiş çatdırılma borusu daha sonra endotrakeal boruya daxil edildi və ucu gözlənilən tətbiq olunan maqnit sahəsinin ən güclü hissəsinə yerləşdirildi.Şəklin alınması Arduino əsaslı vaxt qutumuza qoşulmuş nəfəs detektorundan istifadə etməklə idarə olundu və bütün siqnallar (məsələn, temperatur, tənəffüs, çekimin açılması/bağlanması və təsvirin əldə edilməsi) Powerlab və LabChart (AD Instruments, Sidney, Avstraliya) istifadə edərək qeydə alınıb. 22 Şəkil çəkərkən Korpus mövcud olmadıqda, iki IP kamera (Panasonic BB-SC382) bir-birinə təxminən 90° yerləşdirildi və görüntüləmə zamanı maqnitin traxeyaya nisbətən mövqeyini idarə etmək üçün istifadə edildi (Şəkil 2b, c).Hərəkət artefaktlarını minimuma endirmək üçün terminal tənəffüs axını platosu zamanı hər nəfəs üçün bir şəkil əldə edilmişdir.
Maqnit, görüntüləmə orqanının kənarında uzaqdan yerləşə bilən ikinci mərhələyə əlavə olunur.Maqnitin müxtəlif mövqeləri və konfiqurasiyaları sınaqdan keçirilmişdir, o cümlədən: traxeyanın üstündə təxminən 30° bucaq altında yerləşdirilmişdir (konfiqurasiyalar Şəkil 2a və 3a-da göstərilmişdir);bir maqnit heyvanın üstündə, digəri aşağıda, qütblər cazibə üçün təyin edilmiş (Şəkil 3b)., heyvanın üstündə bir maqnit və aşağıda bir maqnit, itələmə üçün təyin edilmiş dirəklərlə (Şəkil 3c) və yuxarıda və traxeyaya perpendikulyar olan bir maqnit (Şəkil 3d).Heyvanı və maqniti quraşdırdıqdan və sınaqdan keçirilən MP-ni şpris pompasına yüklədikdən sonra, şəkilləri əldə etdikdən sonra 4 µl/san sürətlə 50 µl doza verin.Daha sonra maqnit şəkillər əldə etməyə davam edərkən traxeya boyunca və ya irəli-geri hərəkət edir.
In vivo görüntüləmə üçün maqnit konfiqurasiyası (a) traxeyanın üstündə təxminən 30° bucaq altında bir maqnit, (b) cazibə üçün konfiqurasiya edilmiş iki maqnit, (c) itələmə üçün konfiqurasiya edilmiş iki maqnit, (d) yuxarıda və perpendikulyar olan bir maqnit nəfəs borusu.Müşahidəçi nəfəs borusu vasitəsilə ağızdan ağciyərlərə baxdı və rentgen şüası siçovulun sol tərəfindən keçərək sağ tərəfdən çıxdı.Maqnit ya tənəffüs yolunun uzunluğu boyunca, ya da rentgen şüası istiqamətində nəfəs borusu üzərində sola və sağa hərəkət edir.
Biz həmçinin tənəffüs və ürək döyüntülərinin qarışığı olmadığı halda tənəffüs yollarında hissəciklərin görünmə qabiliyyətini və davranışını müəyyən etməyə çalışdıq.Buna görə də, görüntüləmə dövrünün sonunda pentobarbitalın həddindən artıq dozası səbəbindən heyvanlar insanca evtanizasiya edildi (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, ABŞ; ~65 mg/kg ip).Bəzi heyvanlar görüntüləmə platformasında qaldı və tənəffüs və ürək döyüntüsü dayandırıldıqdan sonra görüntüləmə prosesi təkrarlandı, tənəffüs yollarının səthində MP görünmədikdə əlavə MP dozası əlavə edildi.
Əldə edilən şəkillər düz və qaranlıq sahə üçün düzəldildi və sonra MATLAB-da (R2020a, The Mathworks) yazılmış xüsusi skriptdən istifadə edərək filmə (saniyədə 20 kadr; tənəffüs sürətindən asılı olaraq 15–25 × normal sürət) yığıldı.
LV gen vektorunun çatdırılması ilə bağlı bütün tədqiqatlar Adelaide Universitetinin Laboratoriya Heyvan Tədqiqat Mərkəzində aparıldı və maqnit sahəsinin mövcudluğunda LV-MP çatdırılmasının in vivo gen transferini artıra biləcəyini qiymətləndirmək üçün SPring-8 təcrübəsinin nəticələrindən istifadə etmək məqsədi daşıyırdı. .MF və maqnit sahəsinin təsirlərini qiymətləndirmək üçün iki qrup heyvan müalicə edildi: bir qrupa maqnit yerləşdirmə ilə LV MF, digər qrupa isə maqnitsiz LV MF ilə nəzarət qrupu vuruldu.
LV gen vektorları əvvəllər təsvir üsulları 25, 26 istifadə edərək yaradılmışdır.LacZ vektoru MPSV konstitusiya promotoru (LV-LacZ) tərəfindən idarə olunan nüvə lokallaşdırılmış beta-qalaktosidaza genini ifadə edir, bu da ağciyər toxumasının cəbhələrində və bölmələrində görünən transduksiya edilmiş hüceyrələrdə mavi reaksiya məhsulu yaradır.Titrləmə TU/ml-də titri hesablamaq üçün hemositometrdən istifadə edərək LacZ-müsbət hüceyrələrin sayını əl ilə hesablamaqla hüceyrə kulturalarında aparılmışdır.Daşıyıcılar -80°C temperaturda dondurulur, istifadə etməzdən əvvəl əridilir və 1:1 nisbətində qarışdırılaraq və çatdırılmadan əvvəl ən azı 30 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edilərək CombiMag-a bağlanır.
Normal Sprague Dawley siçovulları (n = 3/qrup, 0,4 mq/kq medetomidin (Domitor, Ilium, Avstraliya) və 60 mq/kq ketamin (Ilium, Avstraliya) qarışığı ilə ~ 2-3 anesteziya edilmiş ip, 1 aylıq yaşda) ip ) 16 Ga venadaxili kanula ilə inyeksiya və qeyri-cərrahi ağızdan kanyulyasiya.Traxeyanın tənəffüs yollarının toxumasının LV transduksiyasını qəbul etməsini təmin etmək üçün, traxeyanın tənəffüs yolunun səthinin tel zənbillə (N-Daire, ucu olmayan nitinol daşı çıxaran NTSE-022115) eksenel surətdə sürtüldüyü daha əvvəl təsvir edilmiş mexaniki pozğunluq protokolumuzdan istifadə etməklə şərtləndirilmişdir -UDH , Cook Medical, ABŞ) 30 p28.Daha sonra, biotəhlükəsizlik kabinetində pozğunluqdan təxminən 10 dəqiqə sonra LV-MP-nin trakeal administrasiyası aparıldı.
Bu təcrübədə istifadə olunan maqnit sahəsi in vivo rentgen tədqiqatına bənzər şəkildə konfiqurasiya edilmişdir, eyni maqnitlər distillə stent sıxacları ilə nəfəs borusu üzərində tutulmuşdur (Şəkil 4).50 µl həcm (2 x 25 µl alikot) LV-MP, əvvəllər təsvir olunduğu kimi, gel ucu olan pipetdən istifadə etməklə nəfəs borusu (n = 3 heyvan) vasitəsilə çatdırıldı.Nəzarət qrupu (n = 3 heyvan) maqnit istifadə etmədən eyni LV-MP aldı.İnfuziya başa çatdıqdan sonra kanül endotrakeal borudan çıxarılır və heyvan ekstubasiya edilir.Maqnit çıxarılmazdan əvvəl 10 dəqiqə yerində qalır.Siçovullara meloksikam (1 ml/kq) (Ilium, Avstraliya) subkutan yolla doza verildi, ardınca 1 mq/kq atipamazol hidroxlorid (Antisedan, Zoetis, Avstraliya) intraperitoneal yeridilməsi ilə anesteziya dayandırıldı.Siçovullar anesteziyadan tam sağalana qədər isti saxlanıldı və müşahidə edildi.
Bioloji təhlükəsizlik şkafında LV-MP çatdırma cihazı.ET borusunun açıq boz Luer-lock qolunun ağızdan çıxdığını və şəkildə göstərilən gel pipetkanın ucunun ET borusu vasitəsilə nəfəs borusuna istədiyiniz dərinliyə daxil edildiyini görə bilərsiniz.
LV-MP administrasiya prosedurundan bir həftə sonra heyvanlar 100% CO2 inhalyasiyası ilə insanca qurban edildi və standart X-gal müalicəmizdən istifadə edərək LacZ ifadəsi qiymətləndirildi.Endotraxeal borunun yerləşdirilməsi ilə bağlı hər hansı mexaniki zədənin və ya mayenin tutulmasının analizə daxil edilməməsini təmin etmək üçün üç ən kaudal qığırdaq halqası çıxarıldı.Təhlil üçün iki yarısını əldə etmək üçün hər bir nəfəs borusu uzununa kəsildi və lüminal səthi vizuallaşdırmaq üçün Minutien iynəsi (İncə Elm Alətləri) istifadə edərək, silikon rezin (Sylgard, Dow Inc) olan bir fincana yerləşdirildi.Transduksiya edilmiş hüceyrələrin paylanması və xarakteri DigiLite kamerası və TCapture proqramı (Tucsen Photonics, Çin) ilə Nikon mikroskopundan (SMZ1500) istifadə edərək frontal fotoqrafiya ilə təsdiq edilmişdir.Şəkillər traxeyanın bütün uzunluğu addım-addım göstərilməklə 20x böyüdülmə ilə (txəyin tam eni üçün maksimum parametr daxil olmaqla) əldə edilib və şəkillərin “tikilməsinə” imkan vermək üçün hər bir şəkil arasında kifayət qədər üst-üstə düşür.Hər bir traxeyanın təsvirləri daha sonra planar hərəkət alqoritmindən istifadə edərək Composite Image Editor versiyası 2.0.3 (Microsoft Research) istifadə edərək vahid kompozit təsvirdə birləşdirildi. Hər bir heyvandan alınan trakeal kompozit təsvirlər daxilində LacZ ifadəsinin sahəsi əvvəllər təsvir edildiyi kimi avtomatlaşdırılmış MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) ilə ölçüldü28, 0,35 < Hue < 0,58, Doyma > 0,15 və Dəyər < 0,7 parametrlərindən istifadə etməklə. Hər bir heyvandan alınan trakeal kompozit şəkillərdə LacZ ifadəsinin sahəsi əvvəllər təsvir edildiyi kimi avtomatlaşdırılmış MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) ilə ölçüldü28, 0,35 < Hue < 0,58, Doyma > 0,15 və Dəyər < 0,7. MATLAB avtomatlaşdırılmış ssenarisini istifadə edərək (R2020a, MathWorks). 0,15 və fərq <0 ,7. Hər bir heyvanın kompozit traxeya şəkillərində LacZ ifadəsinin sahəsi əvvəllər təsvir edildiyi kimi avtomatlaşdırılmış MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) istifadə edərək ölçüldü28 0.35 parametrləri ilə0,15 və dəyəri<0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图图合图图国行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复所 气管 复所表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 …………………………………………………………………………………………………….. MATLAB (R2020a, MathWorks) ilə avtomatik rejimdə işləyən trahei ilə təchiz olunmuş ekspressiya LacZ, nə qədər istifadə olunur, nə qədər çox istifadə olunur <50, 0,000, kəşf <0,7 . Hər bir heyvanın traxeyasının kompozit şəkillərindəki LacZ ifadə sahələri, əvvəllər 0.35 < hue < 0.58, doyma > 0.15 və dəyər < 0.7 parametrləri ilə təsvir edildiyi kimi avtomatlaşdırılmış MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) istifadə edərək ölçüldü.GIMP v2.10.24-də toxuma konturlarını izləməklə, toxuma sahəsini müəyyən etmək və traxeya toxumasından kənarda hər hansı yanlış aşkarlamaların qarşısını almaq üçün hər bir kompozit təsvir üçün əl ilə maska ​​yaradılmışdır.Hər bir heyvanın bütün kompozit şəkillərindən ləkələnmiş sahələr həmin heyvan üçün ümumi ləkələnmiş sahəni vermək üçün cəmləndi.Boyanmış sahə daha sonra normallaşdırılmış sahə əldə etmək üçün maskanın ümumi sahəsinə bölündü.
Hər bir nəfəs borusu parafinə basdırılmış və 5 µm qalınlığında kəsilmişdir.Bölmələr 5 dəqiqə ərzində neytral sürətli qırmızı rənglə əks olundu və şəkillər Nikon Eclipse E400 mikroskopu, DS-Fi3 kamerası və NIS elementlərinin çəkiliş proqramı (versiya 5.20.00) vasitəsilə əldə edildi.
Bütün statistik təhlillər GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) proqramında aparılmışdır.Statistik əhəmiyyət p ≤ 0,05 səviyyəsində müəyyən edilmişdir.Normallıq Shapiro-Wilk testindən istifadə edilərək yoxlanıldı və LacZ boyanmasında fərqlər qoşalaşdırılmamış t-testi ilə qiymətləndirildi.
Cədvəl 1-də təsvir edilən altı MP PCXI tərəfindən tədqiq edildi və görünürlük Cədvəl 2-də təsvir edilmişdir. İki polistirol MP (MP1 və MP2; müvafiq olaraq 18 µm və 0.25 µm) PCXI tərəfindən görünmədi, lakin qalan nümunələr müəyyən edilə bilər. (nümunələr Şəkil 5-də göstərilmişdir).MP3 və MP4 zəif görünür (10-15% Fe3O4; müvafiq olaraq 0,25 µm və 0,9 µm).Baxmayaraq ki, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) sınaqdan keçirilmiş ən kiçik hissəciklərdən bir neçəsini ehtiva edir, lakin bu, ən bariz idi.CombiMag MP6 məhsulunu ayırd etmək çətindir.Bütün hallarda, maqniti kapilyarla paralel olaraq irəli və geri hərəkət etdirərək, MF-ləri aşkar etmək qabiliyyətimiz çox yaxşılaşdırıldı.Maqnitlər kapilyardan uzaqlaşdıqca, hissəciklər uzun zəncirlərdə çıxarıldı, lakin maqnitlər yaxınlaşdıqca və maqnit sahəsinin gücü artdıqca hissəciklər kapilyarın yuxarı səthinə doğru miqrasiya etdikcə hissəcik zəncirləri qısaldı (bax. Əlavə Video S1 : MP4), səthdə hissəciklərin sıxlığını artırır.Əksinə, maqnit kapilyardan çıxarıldıqda sahənin gücü azalır və MP-lər kapilyarın yuxarı səthindən uzanan uzun zəncirlərə yenidən düzülür (bax. Əlavə Video S2: MP4).Maqnit hərəkətini dayandırdıqdan sonra hissəciklər tarazlıq vəziyyətinə gəldikdən sonra bir müddət hərəkət etməyə davam edir.MP kapilyarın yuxarı səthinə doğru və ondan uzaqlaşdıqca, maqnit hissəcikləri mayenin içindən zibil çəkməyə meyllidir.
PCXI altında MP-nin görünməsi nümunələr arasında əhəmiyyətli dərəcədə dəyişir.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 və (d) MP6.Burada göstərilən bütün şəkillər kapilyardan təxminən 10 mm yuxarıda yerləşən maqnitlə çəkilmişdir.Görünən böyük dairələr, faza kontrastlı təsvirin qara və ağ kənar xüsusiyyətlərini aydın şəkildə göstərən, kapilyarlarda sıxılmış hava kabarcıklarıdır.Qırmızı qutu kontrastı artıran böyütməni göstərir.Qeyd edək ki, bütün rəqəmlərdəki maqnit dövrələrinin diametrləri miqyaslı deyil və göstəriləndən təxminən 100 dəfə böyükdür.
Maqnit kapilyarın yuxarı hissəsi boyunca sola və sağa hərəkət etdikcə, MP siminin bucağı maqnitlə uyğunlaşmaq üçün dəyişir (Şəkil 6-a baxın), beləliklə maqnit sahəsinin xətlərini müəyyənləşdirir.MP3-5 üçün akkord eşik bucağına çatdıqdan sonra hissəciklər kapilyarın yuxarı səthi boyunca sürüklənir.Bu, tez-tez millət vəkillərinin maqnit sahəsinin ən güclü olduğu yerə yaxın daha böyük qruplara toplanması ilə nəticələnir (bax: Əlavə Video S3: MP5).Bu, xüsusilə kapilyarın sonuna yaxın görüntüləmə zamanı aydın olur ki, bu da MP-nin maye-hava interfeysində toplanmasına və konsentrasiyasına səbəb olur.MP3-5-dəkilərdən daha çətin ayırd etmək çətin olan MP6-dakı hissəciklər maqnit kapilyar boyunca hərəkət edərkən sürüklənmədi, lakin MP telləri ayrılaraq hissəcikləri göz önündə qoydu (bax. Əlavə Video S4: MP6).Bəzi hallarda tətbiq olunan maqnit sahəsi maqnitin görüntüləmə yerindən uzun bir məsafədə hərəkət etdirilməsi ilə azaldıqda, qalan millət vəkilləri simdə qalaraq, cazibə qüvvəsi ilə yavaş-yavaş borunun alt səthinə enirdilər (bax. Əlavə Video S5: MP3) .
Maqnit kapilyardan yuxarı sağa doğru hərəkət etdikcə MP siminin bucağı dəyişir.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 və (d) MP6.Qırmızı qutu kontrastı artıran böyütməni göstərir.Nəzərə alın ki, əlavə videolar məlumat məqsədi daşıyır, çünki onlar mühüm hissəcik strukturunu və bu statik şəkillərdə vizuallaşdırıla bilməyən dinamik məlumatları ortaya qoyur.
Testlərimiz göstərdi ki, maqnitin nəfəs borusu boyunca yavaş-yavaş irəli-geri hərəkət etməsi in vivo mürəkkəb hərəkət kontekstində MF-nin vizuallaşdırılmasını asanlaşdırır.Polistirol muncuqları (MP1 və MP2) kapilyarda görünmədiyi üçün in vivo testlər aparılmadı.Qalan dörd MF-nin hər biri maqnitin uzun oxu traxeya üzərində şaquli istiqamətdə təxminən 30° bucaq altında yerləşdirilməklə in vivo sınaqdan keçirildi (bax Şəkil 2b və 3a), çünki bu, daha uzun MF zəncirləri ilə nəticələndi və daha təsirli oldu. maqnitdən daha çox..konfiqurasiya dayandırıldı.Heç bir canlı heyvanın nəfəs borusunda MP3, MP4 və MP6 tapılmayıb.Heyvanları insancasına öldürdükdən sonra siçovulların tənəffüs yollarını görüntüləyərkən, şpris nasosundan istifadə edərək əlavə həcm əlavə edildikdə belə hissəciklər görünməz qaldı.MP5 ən yüksək dəmir oksid tərkibinə malik idi və yeganə görünən hissəcik idi, buna görə də MP davranışını in vivo qiymətləndirmək və xarakterizə etmək üçün istifadə edilmişdir.
MF-nin daxil edilməsi zamanı maqnitin nəfəs borusu üzərində yerləşdirilməsi çoxlu sayda MF-nin görmə sahəsində cəmləşməsi ilə nəticələndi, lakin hamısı deyil.Hissəciklərin traxeyaya daxil olması insan tərəfindən evtanaziya edilmiş heyvanlarda ən yaxşı şəkildə müşahidə olunur.Şəkil 7 və Əlavə Video S6: MP5 ventral traxeyanın səthində hissəciklərin sürətli maqnit tutulmasını və düzülməsini göstərir ki, bu da millət vəkillərinin traxeyanın istənilən sahələrinə yönəldilə biləcəyini göstərir.MF çatdırıldıqdan sonra nəfəs borusu boyunca daha distal axtarış zamanı bəzi MF-lər karinaya daha yaxın tapıldı ki, bu da bütün MF-ləri toplamaq və saxlamaq üçün kifayət qədər maqnit sahəsinin gücünün olmadığını göstərir, çünki onlar mayenin tətbiqi zamanı maksimum maqnit sahəsinin gücü bölgəsi vasitəsilə çatdırılmışdır.proses.Bununla belə, doğuşdan sonrakı MP konsentrasiyaları görüntü sahəsi ətrafında daha yüksək idi və bu, bir çox millət vəkilinin tətbiq olunan maqnit sahəsinin gücünün ən yüksək olduğu hava yolu bölgələrində qaldığını göstərir.
MP5-in (a) əvvəl və (b) görüntüləmə sahəsinin yuxarısına yerləşdirilən maqnit ilə yaxınlarda evtanaziya edilmiş siçovulun nəfəs borusuna çatdırılmasından sonrakı şəkillər.Təsvir edilən sahə iki qığırdaqlı halqa arasında yerləşir.MP çatdırılmazdan əvvəl tənəffüs yollarında bir az maye var.Qırmızı qutu kontrastı artıran böyütməni göstərir.Bu şəkillər S6: MP5 Əlavə Videoda təqdim olunan videodan götürülüb.
Maqnitin traxeya boyunca in vivo hərəkəti, kapilyarlarda müşahidə edilənə bənzər hava yolu səthində MP zəncirinin bucağında dəyişikliklə nəticələndi (bax Şəkil 8 və Əlavə Video S7: MP5).Ancaq bizim araşdırmamızda millət vəkilləri kapilyarların edə biləcəyi kimi canlı tənəffüs yollarının səthi boyunca sürüklənə bilmədi.Bəzi hallarda maqnit sola və sağa hərəkət etdikcə MP zənciri uzanır.Maraqlıdır ki, biz onu da aşkar etdik ki, maqnit traxeya boyunca uzununa hərəkət etdikdə hissəciklər zənciri mayenin səth qatının dərinliyini dəyişir, maqnit birbaşa yuxarıda hərəkət etdikdə və hissəciklər zənciri şaquli mövqeyə çevrildikdə genişlənir (bax. Əlavə Video S7).: MP5 0:09, aşağı sağ).Xarakterik hərəkət nümunəsi maqnit traxeyanın yuxarı hissəsindən yan tərəfə köçürüldükdə dəyişdi (yəni, nəfəs borusu boyunca deyil, heyvanın sola və ya sağına).Hərəkətləri zamanı hissəciklər hələ də aydın görünürdü, lakin maqnit traxeyadan çıxarıldıqda hissəcik tellərinin ucları görünməyə başladı (bax. Əlavə Video S8: MP5, 0:08-dən başlayaraq).Bu, şüşə kapilyarda tətbiq olunan maqnit sahəsinin təsiri altında maqnit sahəsinin müşahidə edilən davranışı ilə uyğun gəlir.
Canlı anesteziya edilmiş siçovulun nəfəs borusunda MP5-i göstərən nümunə şəkillər.(a) Maqnit traxeyanın yuxarısında və solunda, sonra (b) maqniti sağa köçürdükdən sonra şəkilləri əldə etmək üçün istifadə olunur.Qırmızı qutu kontrastı artıran böyütməni göstərir.Bu şəkillər S7-nin Əlavə Videosunda təqdim olunan videodandır: MP5.
İki qütb traxeyanın üstündə və altında şimal-cənub istiqamətinə uyğunlaşdırıldıqda (yəni, cəlbedici; Şəkil 3b) MP akkordları daha uzun görünür və nəfəs borunun dorsal səthində deyil, yan divarında yerləşirdi. nəfəs borusu (Əlavə bax).Video S9: MP5).Bununla belə, bir yerdə (yəni, traxeyanın dorsal səthində) yüksək konsentrasiyalı hissəciklər, adətən bir maqnit cihazı ilə baş verən ikili maqnit qurğusundan istifadə edərək maye tətbiq edildikdən sonra aşkar edilməmişdir.Sonra, bir maqnit əks qütbləri dəf etmək üçün konfiqurasiya edildikdə (Şəkil 3c), çatdırıldıqdan sonra görünüş sahəsində görünən hissəciklərin sayı artmadı.Hər iki maqnit konfiqurasiyasını qurmaq, müvafiq olaraq maqnitləri çəkən və ya itələyən yüksək maqnit sahəsinin gücünə görə çətin olur.Quraşdırma daha sonra tənəffüs yollarına paralel, lakin tənəffüs yollarından 90 dərəcə bucaq altında keçən tək bir maqnitlə dəyişdirildi ki, güc xətləri traxeyanın divarını ortoqonal olaraq keçdi (Şəkil 3d), bu oriyentasiya üzərində hissəciklərin yığılma ehtimalını müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. yan divar.müşahidə olunsun.Bununla belə, bu konfiqurasiyada müəyyən edilə bilən MF yığılma hərəkəti və ya maqnit hərəkəti yox idi.Bütün bu nəticələrə əsasən, gen daşıyıcılarının in vivo tədqiqatları üçün tək maqnit və 30 dərəcə oriyentasiya ilə konfiqurasiya seçilmişdir (şəkil 3a).
Heyvan insanca qurban verildikdən dərhal sonra bir neçə dəfə təsvir edildikdə, müdaxilə edən toxuma hərəkətinin olmaması o demək idi ki, maqnitin tərcümə hərəkətinə uyğun olaraq "yırğalanan" aydın qığırdaqlararası sahədə daha incə, qısa hissəcik xətləri müəyyən edilə bilər.MP6 hissəciklərinin varlığını və hərəkətini aydın şəkildə görmək.
LV-LacZ titri 1,8 x 108 IU/mL idi və CombiMag MP (MP6) ilə 1:1 nisbətində qarışdırıldıqdan sonra heyvanlara 50 µl 9 x 107 IU/ml LV vasitəsi (yəni 4,5) traxeya dozası vuruldu. x 106 TU/siçovul).).).Bu tədqiqatlarda, əmək zamanı maqniti hərəkət etdirmək əvəzinə, LV transduksiyasının (a) bir maqnit sahəsinin olmadığı zaman vektor çatdırılması ilə müqayisədə yaxşılaşdırıla biləcəyini və (b) tənəffüs yolunun mümkün olub olmadığını müəyyən etmək üçün maqniti bir vəziyyətdə sabitlədik. diqqət mərkəzində olmaq.Hüceyrələr yuxarı tənəffüs yollarının maqnit hədəf sahələrində ötürülür.
Maqnitlərin olması və CombiMag-ın LV vektorları ilə birlikdə istifadəsi, bizim standart LV vektor çatdırılma protokolumuz kimi heyvan sağlamlığına mənfi təsir göstərməmişdir.Mexanik pozğunluğa məruz qalan trakeal bölgənin frontal şəkilləri (Əlavə Şəkil 1) LV-MP ilə müalicə olunan qrupun maqnit varlığında əhəmiyyətli dərəcədə yüksək transduksiya səviyyəsinə malik olduğunu göstərdi (Şəkil 9a).Nəzarət qrupunda yalnız az miqdarda mavi LacZ boyanması mövcud idi (Şəkil 9b).X-Qal ilə boyanmış normallaşdırılmış bölgələrin kəmiyyəti göstərdi ki, LV-MP-nin maqnit sahəsinin mövcudluğunda tətbiqi təxminən 6 dəfə yaxşılaşma ilə nəticələndi (Şəkil 9c).
LV-MP (a) bir maqnit sahəsinin mövcudluğunda və (b) bir maqnit olmadıqda trakeal transduksiyanı göstərən kompozit şəkillərin nümunəsi.(c) Bir maqnit istifadəsi ilə traxeyada LacZ transduksiyasının normallaşdırılmış sahəsində statistik əhəmiyyətli yaxşılaşma (*p = 0.029, t-test, hər qrup üçün n = 3, orta ± standart səhv).
Neytral sürətli qırmızı ləkələnmiş hissələr (Əlavə Şəkil 2-də göstərilən nümunə) LacZ ilə boyanmış hüceyrələrin əvvəllər bildirildiyi kimi eyni nümunədə və eyni yerdə olduğunu göstərdi.
Tənəffüs yollarının gen terapiyasında əsas problem, maraq zonalarında daşıyıcı hissəciklərin dəqiq lokalizasiyası və hava axını və aktiv selik klirensi şəraitində mobil ağciyərdə yüksək transduksiya effektivliyinin əldə edilməsi olaraq qalır.Kistik fibrozda tənəffüs xəstəliklərinin müalicəsi üçün nəzərdə tutulmuş LV daşıyıcıları üçün daşıyıcı hissəciklərin keçirici tənəffüs yollarında qalma müddətinin artırılması indiyədək əlçatmaz məqsəd olmuşdur.Castellani və başqalarının qeyd etdiyi kimi, transduksiyanı artırmaq üçün maqnit sahələrinin istifadəsi elektroporasiya kimi digər gen çatdırılma üsullarından üstünlüklərə malikdir, çünki o, sadəliyi, qənaətcilliyi, lokal çatdırılmanı, artan səmərəliliyi və daha qısa inkubasiya müddətini birləşdirə bilər.və ola bilsin ki, avtomobilin daha aşağı dozası10.Bununla belə, xarici maqnit qüvvələrin təsiri altında tənəffüs yollarında maqnit hissəciklərinin in vivo çökməsi və davranışı heç vaxt təsvir edilməmişdir və əslində bu metodun intakt canlı hava yollarında gen ifadə səviyyələrini artırmaq qabiliyyəti in vivo nümayiş etdirilməmişdir.
PCXI sinxrotronunda apardığımız in vitro təcrübələrimiz göstərdi ki, sınaqdan keçirdiyimiz bütün hissəciklər, MP polistirol istisna olmaqla, istifadə etdiyimiz görüntüləmə qurğusunda görünür.Maqnit sahəsinin mövcudluğunda maqnit sahələri tellər əmələ gətirir ki, onların uzunluğu hissəciklərin növü və maqnit sahəsinin gücü (yəni, maqnitin yaxınlığı və hərəkəti) ilə bağlıdır.Şəkil 10-da göstərildiyi kimi, müşahidə etdiyimiz sətirlər hər bir fərdi hissəcik maqnitləşdikcə və öz yerli maqnit sahəsini induksiya etdikcə yaranır.Bu ayrı-ayrı sahələr digər oxşar hissəciklərin toplanmasına və digər hissəciklərin yerli cazibə və itələmə qüvvələrindən gələn yerli qüvvələr hesabına qrup simli hərəkətlərlə birləşməsinə səbəb olur.
(a, b) maye ilə dolu kapilyarların və (c, d) hava ilə doldurulmuş nəfəs borusu içərisində əmələ gələn hissəciklərin zəncirlərini göstərən diaqram.Qeyd edək ki, kapilyarlar və nəfəs borusu miqyasda çəkilmir.Panel (a) həmçinin zəncirlərdə düzülmüş Fe3O4 hissəciklərini ehtiva edən MF-nin təsvirini ehtiva edir.
Maqnit kapilyar üzərində hərəkət etdikdə, hissəcik siminin bucağı Fe3O4 ehtiva edən MP3-5 üçün kritik həddə çatdı, bundan sonra hissəcik simi artıq orijinal mövqeyində qalmadı, səth boyunca yeni mövqeyə keçdi.maqnit.Bu təsir çox güman ki, şüşə kapilyarın səthi bu hərəkətin baş verməsinə imkan verəcək qədər hamar olduğundan baş verir.Maraqlıdır ki, MP6 (CombiMag) bu şəkildə davranmadı, ola bilsin ki, hissəciklər daha kiçik idi, fərqli örtük və ya səth yükü var idi və ya xüsusi daşıyıcı maye onların hərəkət qabiliyyətinə təsir etdi.CombiMag hissəcik təsvirindəki kontrast da daha zəifdir, bu, maye və hissəciklərin eyni sıxlığa malik ola biləcəyini və buna görə də asanlıqla bir-birinə doğru hərəkət edə bilməyəcəyini göstərir.Maqnit çox sürətli hərəkət edərsə, hissəciklər də ilişib qala bilər ki, bu da maqnit sahəsinin gücünün mayedəki hissəciklər arasındakı sürtünməni həmişə üstələyə bilməyəcəyini göstərir ki, bu da maqnit sahəsinin gücünün və maqnit ilə hədəf sahəsi arasındakı məsafənin heç bir nəticə verməməsi lazım olduğunu göstərir. sürpriz.vacibdir.Bu nəticələr həmçinin göstərir ki, maqnitlər hədəf bölgədən axan bir çox mikrohissəcikləri tuta bilsələr də, CombiMag hissəciklərini traxeyanın səthi boyunca hərəkət etdirmək üçün maqnitlərə etibar etmək mümkün deyil.Beləliklə, biz in vivo LV MF tədqiqatlarında tənəffüs yolu ağacının xüsusi sahələrini fiziki olaraq hədəfləmək üçün statik maqnit sahələrindən istifadə etməli olduğu qənaətinə gəldik.
Zərrəciklər bədənə daxil olduqdan sonra, onları bədənin mürəkkəb hərəkət edən toxuması kontekstində müəyyən etmək çətindir, lakin MP tellərini "hərəkətləmək" üçün maqnitin traxeya üzərində üfüqi şəkildə hərəkət etdirilməsi ilə onların aşkarlanması qabiliyyəti təkmilləşdirilmişdir.Real vaxt rejimində görüntüləmə mümkün olsa da, heyvan insan tərəfindən öldürüldükdən sonra hissəciklərin hərəkətini ayırd etmək daha asandır.MP konsentrasiyaları adətən maqnit görüntüləmə sahəsinin üzərində yerləşdirildikdə bu yerdə ən yüksək idi, baxmayaraq ki, bəzi hissəciklər adətən traxeyanın daha aşağısında tapılırdı.İn vitro tədqiqatlardan fərqli olaraq, hissəciklər bir maqnitin hərəkəti ilə traxeyaya sürüklənə bilməz.Bu tapıntı traxeyanın səthini örtən mucusun adətən inhalyasiya olunmuş hissəcikləri necə emal etdiyi, onları selikli qişada tutduğu və sonradan onları selikli-siliar təmizləmə mexanizmi vasitəsilə təmizləməsi ilə uyğun gəlir.
Biz fərz etdik ki, cazibə üçün traxeyanın üstündə və altındakı maqnitlərdən istifadə (Şəkil 3b) bir nöqtədə yüksək konsentrasiyalı maqnit sahəsinə deyil, daha vahid maqnit sahəsinə səbəb ola bilər ki, bu da potensial olaraq hissəciklərin daha vahid paylanması ilə nəticələnir..Bununla belə, ilkin araşdırmamız bu fərziyyəni dəstəkləmək üçün aydın dəlil tapmadı.Eynilə, dəf etmək üçün bir cüt maqnit təyin etmək (Şəkil 3c) görüntü sahəsində daha çox hissəciklərin çökməsi ilə nəticələnmədi.Bu iki tapıntı nümayiş etdirir ki, ikili maqnitli quraşdırma MP işarəsinin yerli nəzarətini əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırmır və nəticədə yaranan güclü maqnit qüvvələrini tənzimləmək çətindir və bu yanaşma daha az praktik edir.Eynilə, maqnitin traxeyanın üstündə və boyunca istiqamətləndirilməsi (Şəkil 3d) də təsvir edilən ərazidə qalan hissəciklərin sayını artırmadı.Bu alternativ konfiqurasiyalardan bəziləri çöküntü zonasında maqnit sahəsinin gücünün azalması ilə nəticələndiyi üçün uğurlu olmaya bilər.Beləliklə, 30 dərəcə bir maqnit konfiqurasiyası (Şəkil 3a) ən sadə və ən səmərəli in vivo test üsulu hesab olunur.
LV-MP tədqiqatı göstərdi ki, LV vektorları CombiMag ilə birləşdirildikdə və maqnit sahəsinin mövcudluğunda fiziki olaraq pozulduqdan sonra çatdırıldıqda, traxeyada transduksiya səviyyələri nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artıb.Sinxrotron görüntüləmə tədqiqatlarına və LacZ nəticələrinə əsasən, maqnit sahəsinin LV-ni nəfəs borusunda saxlaya bildiyi və dərhal ağciyərin dərinliyinə nüfuz edən vektor hissəciklərinin sayını azaltdığı ortaya çıxdı.Bu cür hədəfləmə təkmilləşdirmələri çatdırılan titrləri, qeyri-məqsədli transduksiyanı, iltihablı və immun yan təsirləri və gen transferi xərclərini azaltmaqla daha yüksək effektivliyə səbəb ola bilər.Vacibdir ki, istehsalçıya görə, CombiMag digər virus vektorları (məsələn, AAV) və nuklein turşuları da daxil olmaqla, digər gen ötürmə üsulları ilə birlikdə istifadə edilə bilər.