Giardia onikibarmaq bağırsağı, diareyanın klinik əlamətləri ilə xüsusilə gənc uşaqlarda geniş yayılmış bağırsaq infeksiyası olan giardiasisə səbəb olan parazitar bir orqanizmdir.Əvvəllər bildirmişdik ki, hüceyrədənkənar G. duodenalis hüceyrədaxili oliqomerizasiyaya bənzər reseptor 3 (NLRP3) bağlayan nukleotidlərin aktivləşməsinə təkan verir və hüceyrədənkənar vezikül (EV) sekresiyası vasitəsilə ev sahibinin iltihab reaksiyalarını tənzimləyir.Bununla belə, bu prosesdə iştirak edən patogenlə əlaqəli duodenokokk EV-nin (GEV) dəqiq molekulyar nümunələri və lyambliozda NLRP3 iltihabının rolu hələ də aydınlaşdırılmalıdır.
GEV-də rekombinant eukaryotik ifadəli plazmidlər pcDNA3.1(+)-alfa-2 və alfa-7.3 giardinləri qurulmuş, siçan birincil peritoneal makrofaqlarına transfektasiya edilmiş və iltihab hədəf molekulu kaspaz-1-in ölçülməsi ilə aşkar edilmişdir.p20 ifadə səviyyəsi ekranlaşdırıldı..G. duodenalis alfa-2 və alfa-7.3 giardines ilkin olaraq NLRP3 iltihabının (NLRP3, pro-interleykin-1 beta [IL-1β], pro-kaspaz-1 və kaspaz-1 p20), IL ifrazının ölçülməsi ilə müəyyən edilmişdir.1β səviyyələri, apoptotik ləkəli protein (ASC) oliqomerizasiya səviyyələri və NLRP3 və ASC-nin immunofluoresan lokalizasiyası.Daha sonra G. duodenalisin patogenliyində NLRP3 iltihabının rolu NLRP3 aktivasiyasının bloklandığı (NLRP3 bloklanmış siçanlar) və bədən çəkisində, duodenal parazitar yükdə və onikibarmaq bağırsaq toxumasında patoloji dəyişikliklərə nəzarət edilən siçanlardan istifadə etməklə qiymətləndirilmişdir.Bundan əlavə, alfa-2 və alfa-7.3 hiardinlərinin NLRP3 iltihabı vasitəsilə in vivo olaraq IL-1β sekresiyasına səbəb olub-olmadığını araşdırdıq və bu molekulların siçanlarda G. duodenalisin patogenliyində rolunu təyin etdik.
Alfa-2 və alfa-7.3 lyambardınları in vitro NLRP3 iltihabının aktivləşməsinə səbəb olur.Bu, p20 kaspaza-1-in aktivləşməsinə, NLRP3, pro-IL-1β və pro-kaspaz-1 zülallarının ifadə səviyyələrinin artmasına, IL-1β ifrazının əhəmiyyətli dərəcədə artmasına, qanda ASA ləkələrinin əmələ gəlməsinə səbəb oldu. sitoplazma və ASA oliqomerizasiyasının induksiyası.NLRP3 iltihabı Penis itkisi siçanlarda G. duodenalisin patogenliyini gücləndirir.NLRP3 ilə bloklanmış siçanlardan gavage ilə kistlərlə müalicə olunan siçanlar, artan sayda trofozoitlər və büzülmüş və budaqlanan nekrotik kriptlərlə xarakterizə olunan duodenal villi ciddi zədələnmələr nümayiş etdirdi.In vivo təcrübələr göstərdi ki, lyambardların alfa-2 və alfa-7.3 NLRP3 iltihabı vasitəsilə IL-1β sekresiyasına səbəb ola bilər və alfa-2 və alfa-7.3 lyambardları ilə immunizasiya siçanlarda G. duodenalisin patogenliyini azaldır.
Birlikdə götürdükdə, bu tədqiqatın nəticələri göstərir ki, giardia alfa-2 və alfa-7.3 ana NLRP3 iltihabının yuxarı tənzimlənməsinə səbəb olur və siçanlarda G. duodenalisin yoluxuculuğunu azaldır ki, bu da lyambliozun qarşısının alınması üçün perspektivli hədəflərdir.
Giardia duodenum nazik bağırsaqda yaşayan və xüsusilə inkişaf etməkdə olan ölkələrdə kiçik uşaqlar arasında hər il 280 milyon lyamblioz xəstəliyinə səbəb olan diareya ilə müşayiət olunan hüceyrədənkənar protozoan parazitdir [1].İnsanlar M. duodenum kistləri ilə çirklənmiş içməli su və ya qida ilə yoluxur, sonra mədəyə daxil olur və mədə şirəsi ilə xaric olur.Giardia duodenum trofozoitləri onikibarmaq bağırsağın epitelinə yapışaraq ürəkbulanma, qusma, ishal, qarın ağrısı və çəki itkisinə səbəb olur.İmmun çatışmazlığı və kistik fibrozu olan insanlar infeksiyaya həssasdırlar.İnfeksiya oral və anal seks zamanı da baş verə bilər [2].Metronidazol, tinidazol və nitazoksanid kimi dərmanlar duodenal infeksiyalar üçün üstünlük verilən müalicə variantlarıdır [3].Bununla belə, bu kemoterapi dərmanları ürəkbulanma, kanserogenez və genotoksisite kimi mənfi yan təsirlərə səbəb olur [4].Buna görə də G. duodenalis infeksiyasının qarşısını almaq üçün daha effektiv strategiyalar işlənib hazırlanmalıdır.
İltihablar patogenin işğalından qorunmağa və iltihab reaksiyalarına vasitəçilik etməyə kömək edən fitri immun cavabın bir hissəsi olan sitozolik zülal komplekslərinin bir sinfidir [5].Bu iltihablar arasında nukleotid bağlayan oliqomerləşmə (NOD) reseptor 3 (NLRP3) nukleotid bağlayan oliqomerləşmə (NLRP3) nukleotid bağlayan iltihaba bənzər iltihab geniş şəkildə tədqiq edilmişdir, çünki o, müxtəlif patogen/zərərlə əlaqəli PAMP nümunələri ilə aşkar edilə bilər. DAMP), fitri immun sistemini tanıyır, aktivləşdirir.və bir çox iltihabi xəstəliklərdə bağırsaq homeostazını tənzimləyir [6,7,8].O, nümunənin tanınması reseptorundan (PRR) NLRP3, adapter apoptotik ləkəli zülaldan (ASC) və effektor prokaspaza-1 və ya prokaspaza-11-dən ibarətdir.NLRP3 iltihabı Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] və Leishmania tədqiqatlarında müşahidə edildiyi kimi, patogen işğala qarşı bir ev sahibi kimi çıxış edir.[11], lakin NLRP3 iltihabının aktivləşdirilməsinin qoruyucu immun cavabları məhdudlaşdırdığı və xəstəliyin gedişatını, məsələn, qurdlarda [12] ağırlaşdırdığı bildirilmişdir.Əvvəlki tapıntılarımıza əsaslanaraq, biz bildirdik ki, hüceyrədənkənar G. duodenalis NLRP3 iltihabının hüceyrədaxili aktivləşməsini tetikler və hüceyrədənkənar vezikülləri (EV) ifraz edərək ev sahibinin iltihab reaksiyalarını modulyasiya edir [13].Bununla belə, in vivo olaraq G. duodenalis infeksiyasında NLRP3 iltihabının rolu hələ də müəyyən edilməmişdir.
Giardinlər əvvəlcə G. duodenalis sitoskeletonunun struktur komponentləri kimi təsvir edilmişdir və nazik bağırsaqda trofozoit hərəkətliliyində və epitelial hüceyrələrin birləşməsində mühüm rol oynayır.Ətraf mühitə daha yaxşı uyğunlaşmaq və onların patogenliyini artırmaq üçün G. duodenalis trophozoites 8 bayraqcıq, 1 orta gövdə və 1 ventral diskdən ibarət unikal sitoskeletal quruluş yaratmışdır [14].Giardia duodenumun trofozoitləri öz sitoskeletindən istifadə edərək yuxarı nazik bağırsağa, xüsusən də onikibarmaq bağırsağa nüfuz edir və enterositlərə yapışırlar.Hüceyrə mübadiləsindən istifadə edərək daim miqrasiya edir və epitel hüceyrələrinə yapışırlar.Buna görə də onların sitoskeleti və virulentliyi arasında sıx əlaqə var.Giardia duodenum üçün səciyyəvi olan lyardinalar sitoskeleton quruluşunun komponentləridir [15] və dörd sinfə bölünürlər: α-, β-, γ- və δ-yardinalar.α-giardin ailəsinin 21 üzvü var ki, onların hamısı fosfolipidləri bağlamaq üçün kalsiumdan asılı qabiliyyətə malikdir [16].Onlar həmçinin sitoskeletonu hüceyrə membranı ilə birləşdirir.G. duodenalis səbəb olduğu ishal olan şəxslərdə α-giardinlər infeksiya zamanı yüksək dərəcədə ekspressiv olur və immunoreaktiv olur [17].Giardia alfa-1 əsasında heteroloji peyvəndlər siçanlarda lyambliozdan qorunur və peyvəndin inkişafı üçün potensial namizəd antigenlərdir [18].Alpha-8 giardin, plazma membranında və flagellada lokallaşdırılmış, lakin ventral diskdə deyil, G. duodenalisdə trofozoitlərin hərəkətliliyini və böyümə sürətini artırır [19].Alpha-14 giardin flagelladakı mikrotubul strukturlarına yapışır və G. duodenalisin canlılığına təsir göstərir [20].Alpha-11 giardin bütün həyat dövrü boyunca bol şəkildə mövcuddur və alfa-11 giardinin həddindən artıq ifadəsi G. duodenalisin özünə zərər verir [21].Bununla belə, alfa-2 giardin və alfa-7.3 giardinin G. duodenalis infeksiyasına və onların əsas mexanizmlərinə qarşı qoruyucu olub-olmadığı aydın deyil.
Bu tədqiqatda rekombinant eukaryotik ifadə plazmidləri pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine və pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine host NLRP3-ü aktivləşdirmək üçün siçan birincil peritoneal makrofaqlarına transfeksiya edilmişdir.Daha sonra iltihablı hədəflər yoxlanıldı.Biz həmçinin G. duodenalisin patogenliyində NLRP3 iltihabının rolunu qiymətləndirdik, alfa-2 və alfa-7,3 lyambardlarının in vivo NLRP3 iltihabının aktivləşməsinə səbəb olub-olmadığını araşdırdıq və giardinin patogenliyində bu iki rolun olduğunu müəyyən etdik. G. duodenalis.Bizim ümumi məqsədimiz G. duodenalis infeksiyasının qarşısının alınması üçün perspektivli hədəflər hazırlamaq idi.
5-8 həftəlik vəhşi tipli (WT) C57BL/6 dişi siçanlar Liaoning Changsheng Experimental Animal Center-dən (Liaoning, Çin) alınıb.Siçanların suya sərbəst çıxışı var idi, sterilizasiya olunmuş qida qəbul etdilər və 12/12 saatlıq işıq/qaranlıq dövründə saxlanıldılar.İnfeksiyadan əvvəl siçanlar ampisilin (1 mq/mL), vankomisin (1 mq/mL) və neomisin (1,4 mq/mL) əlavə edilmiş içməli suda ad libitum antibiotiklər aldılar (hamısı Çindən, Şanxaydan alınıb, süni orqanizmlər) [22] ].].24 saatdan çox yemək və içmək qabiliyyətini itirən və bədən çəkisinin ≥ 20%-ni itirən siçanlar servikal dislokasiya ilə insan tərəfindən evtanaziya edildi.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) 12,5% fetal iribuynuzlu zərdab (FBS; Every Green, Zhejiang, Çin) və 0,1% iribuynuzlu öd (Sigma-Aldrich, St. Missouri, ABŞ) ilə əlavə edilmişdir. ).ABŞ) mikroaerob şəraitdə.Birləşən trofozoitlər buz üzərində toplanmış və sonrakı reproduksiya üçün 1:4 nisbətində keçid edilmişdir.
Giardia duodenum kistləri daha əvvəl təsvir edildiyi kimi induksiya edildi [23], trofozoitlər loqarifmik fazada yığıldı və sonra 1 × 106 trofozoit/mL yekun konsentrasiyasına qədər pH 7.1 (dəyişdirilmiş TYI-S-33) olan kapsulyasiyaya səbəb olan mühitlə seyreltildi.safra konsentrasiyası 0,05% orta).Trofozoitlər anaerob şəraitdə loqarifmik artım fazasına qədər 37°C temperaturda becərildi.Ortanı kistaya səbəb olan mühitə dəyişdirin (pH 7.8; 1% öd konsentrasiyası ilə dəyişdirilmiş TYI-S-33 mühiti) və kultura G. duodenalis 37 ° C-də 48-96 saat ərzində mikroskop altında formalaşan kistlər müşahidə edildi.Trofozoitlərin çoxu kistlərin əmələ gəlməsinə səbəb olduqdan sonra mədəniyyət qarışığı yığıldı və qalan trofozoitləri parçalamaq üçün steril deionlaşdırılmış suda yenidən dayandırıldı.Siçanlarda mədə borusu vasitəsilə sonrakı analizlər üçün kistlər sayılır və 4°C-də saxlanılır.
Giardia ekstrasellüler veziküllər (GEV) daha əvvəl təsvir edildiyi kimi zənginləşdirilmişdir [13].Loqarifmik böyümə fazasındakı trofozoitlər, ekzosomla tükənmiş FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, İsrail) ilə hazırlanmış dəyişdirilmiş TYI-S-33 mühitində 1 × 106 parazit/ml yekun konsentrasiyaya qədər yenidən dayandırıldı və 12 saat inkubasiya edildi.2000 q-da 10 dəqiqə, 10.000 q-da 45 dəqiqə və 100.000 q-da 60 dəqiqə sentrifuqa edilərək mədəniyyət supernatantından təcrid olundu.Çöküntülər fosfat tamponlu şoran məhlulunda (PBS) həll edildi, BCA zülal analiz dəsti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABŞ) ilə ölçüldü və -80°C-də saxlanıldı və ya sonrakı təhlillər üçün birbaşa istifadə edildi.
İlkin siçan peritoneal makrofaqları daha əvvəl təsvir edildiyi kimi hazırlanmışdır [24].Qısaca, siçanlar (6-8 həftəlik) 2,5 ml 2,98% Difco maye tioqlikol mühiti (BD, Franklin Lakes, NJ, ABŞ) yeridildi (peritoneal olaraq [ip]) və 3-4 damağı qidalandırdılar.Evtanaziyadan sonra siçanların qarın boşluğundan makrofaqların süspansiyonu toplanmış və 3 dəfə 1000 q-da 10 dəqiqə sentrifuqa edilmişdir.Yığılan hüceyrələr CD11b markerindən istifadə edərək hüceyrə təmizliyi >98% olana qədər axın sitometriyası ilə aşkar edildi, sonra 6 quyulu hüceyrə kulturası lövhələrinə (4,5 x 106 hüceyrə/quyu) əlavə edildi və 37°C-də 10% FBS (Bioindustry) ilə inkubasiya edildi.və 5% CO2.
1 ml TRIzol reagentində (Vazyme, Nankinq, Çin) 1 × 107 trofozoitdən RNT çıxarıldı, MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Çin) istifadə edərək ümumi G. duodenalis RNT-dən genomik DNT çıxarıldı və tamamlayıcı DNT (cDNA) sintez edildi. istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq MonScript RTIIII Super Mix (Monad) istifadə edərək.
Hədəf G. duodenalis geni üçün CDS ardıcıllığı məlumatı NCBI GenBank-dan əldə edilmişdir.Hər bir hədəf gen üçün xüsusi qüsursuz klonlama primerlərini dizayn etmək üçün Primer 5.0 istifadə edin.İrəli primer (5′-3′) üç hissədən ibarətdir: xəttiləşdirilmiş vektor pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) ilə üst-üstə düşən ardıcıllıq və ATG və GNN başlanğıc kodonları (əgər birinci baza G deyilsə).Bu ifadənin effektivliyini artırmaq üçün edilir.Bundan əlavə, ən azı 16 bp birləşdirilmiş əsaslar (GC tərkibi 40-60%/Tm təqribən 55 °C).Əks primer (5′-3′) iki hissədən, EcoRV-xəttiləşdirilmiş vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) ilə üst-üstə düşən ardıcıllıq və ən azı 16 bp birləşmiş bazadan ibarətdir.(son iki dayanacaq istisna olmaqla).əsaslar) rekombinant plazmidlərin etiketlənmiş zülallarını ifadə etməsinə imkan verən AA və ya GA kimi kodon).Primer ardıcıllıqları Cədvəl 1-də verilmişdir və Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Çin) tərəfindən sintez edilmişdir.
Hədəflər şablon kimi hazırlanmış G. duodenalis cDNA-dan istifadə etməklə Pfu DNT polimeraz (Tiangen, Pekin, Çin) və ya Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pekin, Çin) istifadə edilməklə gücləndirilmişdir.Eukaryotik ifadə vektor plazmidi pcDNA3.1(+) məhdudlaşdırıcı ferment EcoRV ilə xəttiləşdirilmiş və Fast AP (Thermo Fisher Scientific) istifadə edərək fosforsuzlaşdırılmışdır.Xəttiləşdirilmiş pcDNA3.1(+) fraqmentləri və gücləndirilmiş hədəf gen fraqmentləri DNT gel təmizləmə dəsti (Tiangen) istifadə edərək təmizləndi və Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) istifadə edərək kəmiyyəti müəyyən edildi.pcDNA3.1(+) fraqmenti və hər bir hədəf gen fraqmenti MonClone tək montaj klonlama qarışığı (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Çin) istifadə edərək rekombinasiya edilmiş və Comate Bioscience Company Limited (Çanqçun, Çin) istifadə edərək DNT ardıcıllığı ilə təsdiq edilmişdir..
Endotoksinsiz pcDNA3.1(+)-alfa-2 və pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 plazmidləri SanPrep Endotoksinsiz Plazmid Mini Kitindən (Sangon Biotech) istifadə edilməklə yaradılmışdır.Elüsyon tamponunda olan EDTA-nın transfeksiya analizinə mane olmaması üçün konsentrasiya 500 ng/µl-dən yuxarı saxlanıldı.İlkin siçan peritoneal makrofaqları tam RPMI 1640 mühiti (Biological Industries) ilə 12 saat ərzində 6 quyu boşqablarda becərildi, sonra penisilin və streptomisini çıxarmaq üçün hüceyrələr 3 dəfə isti PBS-də yuyuldu, sonra isə tam mühitlə zənginləşdirilmiş mühitdə.Endotoksinsiz plazmidlər pcDNA3.1(+)-alfa-2 və pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) 125 μl Opti-MEM azaldılmış serum mühitində (Gibco, Thermo Fisher Scientific) seyreltildi..Sonra 5 µl Lipofectamine 2000 transfeksiya reagenti (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 125 µl aşağı serum Opti-MEM mühitində seyreltildi.Seyreltilmiş endotoksinsiz plazmidi Lipofektamin 2000 ilə qarışdıraraq və qarışığın otaq temperaturunda 5 dəqiqə dayanmasına icazə verərək liposom-DNT komplekslərini hazırlayın.Kompleksləri ayrı-ayrılıqda hər quyudakı hüceyrələrə köçürün və yavaş-yavaş qarışdırın.4 saatdan sonra hüceyrə mədəniyyəti mühiti 2 ml tam RPMI 1640 mühiti ilə əvəz olundu və kultura 24 saat davam etdi.Hüceyrələrə təzə hüceyrə mədəniyyət mühiti əlavə edildi və analiz dizaynından asılı olaraq müxtəlif vaxt nöqtələri üçün inkubasiya edildi.
Süpernatantlardan və hüceyrə lizatlarından zülal nümunələri daha əvvəl təsvir edildiyi kimi hazırlanmışdır [25].Pro-IL-1β, pro-kaspaz-1, kaspaz-1 p20, NLRP3, β-aktin və His-tag üçün membran ötürmə parametrləri 200 mA/90 dəq idi.İnterleykin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, ABŞ), kaspaz-1 (p20) (Adipogen, İsveçrə) və NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, İsveçrə) və 1:5000 üçün Onun S tagen (Amtifilet) hədəflənməsi Wuhan, Çin) və β-aktin (Proteintech, Wuhan, Çin).
Disuksinimid suberat (DSS) ilə çarpaz əlaqə daha əvvəl təsvir edildiyi kimi həyata keçirildi [26].Hüceyrələr 3 dəfə soyuq PBS ilə yuyuldu və 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES və 125 mM NaHCO3 olan 50 µl ASC reaksiya tamponunda (pH 8.0) 27 kalibrli iynə ilə tamamilə parçalandı.Qarışıq 5000 q-da 3 dəqiqə sentrifuqa edildi və qranul 10 µl DSS (DMSO-da 25 mM) və 40 µl ASC reaksiya tamponu ilə 30 dəqiqə 37°C-də tikildi.5000 q-da 10 dəqiqə sentrifuqa edildikdən sonra qranul 40 µl ASC reaksiya tamponu və 10 µl 6x protein yükləmə tamponu (TransGen, Pekin, Çin) məhlulunda həll edildi və sonra məhlul otaq temperaturunda 15 dəqiqə söndürüldü. min., Sonra 10 dəqiqə qaynadın.Protein nümunələri daha sonra 1:500 seyreltmə nisbətində əsas anti-ASC antikorlarından (Wanleibio, Shenyang, Çin) istifadə edərək Western blotlamaya məruz qaldı.
Daha əvvəl təsvir edilmiş prosedurdan sonra [13], hüceyrə mədəniyyətinin supernatantları yığıldı və siçan IL-1 Beta ELISA dəsti (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) istifadə edərək iltihab əleyhinə sitokin IL-1β-nin ifrazı təyin edildi.IL-1β standart əyrisindən istifadə edərək OD450nm dəyərlərini protein konsentrasiyalarına çevirin.
Qapaqlar üzərində örtülmüş hüceyrələr 3 dəfə isti PBS-də yumşaq bir şəkildə yuyuldu, toxuma hüceyrəsi fiksatorunda (Biosharp, Pekin, Çin) otaq temperaturunda (RT) 10 dəqiqə, 0,1% Triton X-Permeabilize 100-də (PBS-də seyreltildi; Biosharp) ) otaq temperaturunda 20 dəqiqə və otaq temperaturunda 2 saat ərzində 5% iribuynuzlu zərdab albuminində (PBS-də) bloklayın.Hüceyrələr daha sonra müvafiq olaraq ASC (1:100 seyreltmə) və ya NLRP3 (1:100 qatılma) və Cy3 etiketli keçi anti-dovşan IgG(H+L) (1:400; EarthOx) qarşı əsas antikorlarla 4°C-də gecə ərzində inkubasiya edildi. , San Francisco, CA, USA) və ya FITC ilə birləşdirilmiş keçi anti-siçan IgG (1:400; Earthox) 37°C-də qaranlıqda 1 saat ərzində gecə.Nüvələr Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Çin) ilə 5 dəqiqə ərzində boyandı və flüoresan mikroskop altında müşahidə edildi (Olympus Corporation, Tokio, Yaponiya).
Siçanlar dörd qrupa bölündü (hər qrupda n = 7): (i) PBS ilə müalicə olunan mənfi nəzarət qrupu (yalnız PBS; 100 µl/siçan PBS ilə gavage, ardınca 3 saat sonra gündəlik peritondaxili 100 µl/siçan PBS) ., davamlı olaraq 7 gün);(ii) MCC950 inhibitoru ilə müalicə olunan mənfi nəzarət qrupu [27] (PBS qavajı vasitəsilə 100 µl/siçan, 3 saat sonra, 10 mq/kq bədən çəkisi [BW] MCC950 [PBS-də] gündəlik olaraq peritondaxili, müddəti 7 gün tətbiq edilmişdir);(iii) G. duodenalis kist infeksiyası qrupu (1,5 x 106 kist/siçan gavage ilə, 3 saat sonra, 100 μl/siçan PBS 7 gün ərzində gündəlik olaraq intraperitoneal olaraq verilir);(iv) G. duodenalis kistinin birləşmiş infeksiya qrupu MCC950 inhibitor müalicəsi qrupu (qavaj vasitəsilə 1,5×106 kist/siçan, 10 mq/kq bədən çəkisi MCC950 gündə 7 gün ərzində 3 saat ərzində peritondaxili).Hər bir siçanın bədən çəkisi gündəlik monitorinq edildi və bütün siçanlar 7-ci gündə evtanaziya edildi.Yığılmış onikibarmaq bağırsaq (3 sm uzunluğunda) 1 ml PBS-də kiçik parçalara kəsilmiş, kistlər 4 ° C-də PBS-də bir gecədə məhv edilmiş və G. duodenalis trophozoites.Təzə duodenum (1 sm uzunluğunda) hematoksilin və eozin (H&E) ilə boyanma üçün təcrid edilmişdir.
Siçanlar iki qrupa bölündü: (i) MOCK nəzarət qrupu və (ii) MCC950 inhibitor qrupu.Hər qrupda beş müalicə var idi (n = 7/müalicə qrupu): (i) PBS müalicəsi mənfi nəzarət qrupu (yalnız PBS; 100 µl/siçan PBS, əzələdaxili (IM) inyeksiya (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plazmid mənfi nəzarət qrupu (100 µg/siçan DNT, əzələdaxili inyeksiya yolu ilə (iii) G. duodenalis kist infeksiyası pozitiv nəzarət qrupu (1,5 x 106 kist/siçan, qavaj vasitəsilə) (iv) a plazmid pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/siçan DNT, əzələdaxili inyeksiya yolu ilə) və (v) plazmid pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/siçan) ilə müalicə olunan qrup DNT, 12 saatlıq keçiddən sonra MCC950 inhibitor qrupundakı siçanlar 7 gün ərzində MCC950 (10 mq/kq bədən çəkisi) gündəlik intraperitoneal inyeksiya aldı, MOCK qrupundakı siçanlar isə bərabər həcmdə PBS müalicəsi aldılar. Qan nümunələri alındı. göz bəbəklərindən siçanlardan toplanmış və bir gecədə 4 °C-də qalmış serum nümunələri IL-1β səviyyələri üçün fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (ELISA) istifadə edərək təcrid edilmişdir.
Otuz beş siçan beş qrupa bölündü (n=7/qrup).1-ci qrup PBS ilə müalicə olunan mənfi nəzarət qrupu idi: siçanlar əzələdaxili olaraq 100 μl PBS və 3 gün sonra gavage ilə qəbul etdilər.2-ci qrup G. duodenalis kistləri ilə yoluxmuş müsbət nəzarət qrupudur: siçanlara 100 μl PBS yeridilmiş və 3 gün sonra 1,5 x 106 kist/siçana mədədaxili yeridilmişdir.Üçüncü qrup – duodenal kist infeksiyası üçün nəzarət qrupu ilə birlikdə pcDNA3.1(+) ilə plazmid immunizasiyası: siçanlar şifahi olaraq 100 μg plazmid DNT pcDNA3.1(+)(im), bir neçəsi üçün 1,5×106 kist/siçan 3 aldılar. günlər.4 və 5-ci qruplar G. duodenalis kist infeksiyası ilə birlikdə rekombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin plazmidi və ya pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin plazmidi idi.Eksperimental qrup: siçanlar 100 µg pcDNA3 qəbul etdilər.1(+)-giardine plazmid DNT (im), sonra 3 gün sonra 1,5 × 106 kist/siçan qavaj vasitəsilə yeridildi.Boru vasitəsilə G. duodenalis kistinin yeridilməsindən sonra hər bir siçanın bədən çəkisi izlənilib.Parazitar yük ölçmələri və HE boyanma analizi üçün təzə duodenum toplandı.
Histopatoloji dəyişikliklər əvvəllər dərc edilmiş prosedura [30] uyğun olaraq təhlil edilmişdir.Təzə onikibarmaq bağırsağı toxuma hüceyrəsi fiksatoru ilə bərkidilmiş, parafinə daxil edilmiş, 4 μm-lik hissələrə kəsilmiş, H&E ilə boyanmış və işıq mikroskopunda təhlil edilmişdir.Yeddi müstəqil siçanın yeddi toxuma bölməsində təmsil olunan patoloji dəyişikliklər müalicədən xəbərsiz bir patoloq tərəfindən qiymətləndirilmiş və 200x böyütmə ilə tutulmuşdur.Villisin uzunluğu və kriptlərin dərinliyi əvvəllər təsvir edilmiş üsullara uyğun olaraq ölçüldü.
Nəticələr in vitro və in vivo üç nüsxədə əldə edilmişdir.Qrafiklər GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ABŞ) istifadə edərək yaradılıb.İki qrup arasındakı fərqlər t-testi ilə, ≥3 qruplar arasındakı fərqlər isə SPSS proqram təminatından (versiya 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, ABŞ) istifadə edərək birtərəfli dispersiya təhlili (ANOVA) ilə təhlil edildi.Verilənlər dispersiyaların homojenliyi üçün Levene testindən sonra Bonferroninin post hoc testindən (B) istifadə edərək təhlil edildi.Əhəmiyyətlilik P<0.05, P<0.01 və P<0.001 (əhəmiyyətli deyil [ns]) kimi ifadə edilir (P>0.05).
Kyoto Genlər və Genomlar Ensiklopediyasında (KEGG) GEV proteomikası ilə bağlı əvvəlki təhlilimiz göstərdi ki, bir çox hədəflər iltihab siqnal yollarının aktivləşdirilməsində iştirak edə bilər [13].Biz iki perspektivli hədəfi, alfa-2 və alfa-7.3 giardinləri seçdik, bu molekulları gücləndirdik və onlardan pcDNA3.1(+) eukaryotik ifadə vektorunu qurmaq üçün istifadə etdik.Ardıcıllıqdan sonra rekombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2 və alfa-7.3 giardin ifadə plazmidləri siçanların ilkin peritoneal makrofaqlarına köçürüldü və iltihabın kaspaz-1 p20 imza proteini (aktivləşdirilmiş kaspaz-1 fraqmenti) müəyyən edildi. iltihaba səbəb ola biləcək əsas molekulları aydınlaşdıran kimi.Nəticələr göstərdi ki, alfa-2 və alfa-7.3 gardines GEV-ə bənzər p20 kaspaz-1 ifadəsini induksiya edə bilər.Müalicə olunmamış neqativ nəzarətdə (yalnız PBS) və pcDNA3.1(+) plazmid nəzarətində kaspaza-1 aktivləşdirilməsinə heç bir təsir aşkar edilməmişdir (Şəkil 1).
pcDNA3.1(+)-alfa-2 və alfa-7.3 giardinləri ilə p20 kaspaza-1 aktivasiyasının ölçülməsi.Rekombinant eukaryotik ifadə plazmidləri pcDNA3.1(+)-alfa-2 və alfa-7.3 lyambardınları (hər zolağın üstündə) ilkin siçan peritoneal makrofaqlarına köçürüldü və mədəniyyət supernatantları 24 saat sonra yığıldı.Western blotting imza kaspaz-1 p20 iltihabi zülalının ifadə səviyyələrini ölçmək üçün istifadə edilmişdir.Mənfi nəzarət kimi yalnız PBS müalicə qrupu (C zolağı) və pcDNA3.1(+) monoterapiya qrupu (pcDNA3.1 zolağı), müsbət nəzarət kimi GEV müalicə qrupu istifadə edilmişdir.Rekombinant zülalın ifadəsi hər bir zülalda histidin etiketinin aşkarlanması ilə təsdiqləndi və gözlənilən zülal zolaqları alfa-2 giardin (38,2 kDa) və alfa-7,3 giardin (37,2 kDa) idi.GEV, Giardia duodenum extracellular vesicles, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearized vektor, SUP, supernatant
Alfa-2 giardin və alfa-7.3 giardinin p20 kaspaz-1 ifadəsini induksiya edib-etmədiyini və ev sahibi NLRP3 iltihab reaksiyasını, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinin və pcDNA3.1(+)-alfanın aktivləşdirilməsində rol oynadığını müəyyən etmək üçün -7.3 giardin rekombinant plazmid DNT ilə ilkin siçan peritoneal makrofaqlarına transfektasiya edilmiş və əsas iltihab zülalları NLRP3-ün ifadə, lokalizasiya və oliqomerizasiya səviyyələri müəyyən edilmişdir.Bu eksperimentdə müsbət nəzarət qrupu kimi GEV istifadə edildi və müalicə olunmayan qrup (yalnız PBS) və ya pcDNA3.1(+) transfeksiya müalicəsi qrupu mənfi qrup idi.Nəticələr göstərdi ki, GEV qrupunda olduğu kimi, giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 və giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-ün rekombinant plazmid DNT-si NLRP3, pro-IL-1β və procaspase-1 və caspase-1 aktivləşdirilməsi (Şəkil 2a).Bundan əlavə, hər iki lyardin əhəmiyyətli IL-1β sekresiyasına səbəb oldu (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.00 ).;alfa-7,3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Şəkil 2b).Əksər ASC zülalları, pcDNA3.1(+)-alfa-2 və ya pcDNA3.1(+)-alfa-dan fərqli olaraq, müalicə olunmayan qrupda və ya pcDNA3.1(+) plazmidi ilə transfeksiya edilmiş müalicə qrupunda monomer idi. 7.3 giardine.ASC oliqomerizasiyası oliqomerik forma göstərən GEV müsbət nəzarət qrupunun və ya qrupunun rekombinant plazmid DNT-sində baş verdi (Şəkil 2c).Bu ilkin məlumatlar alfa-2 giardin və alfa-7,3 giardinin NLRP3 iltihabının aktivləşməsinə səbəb ola biləcəyini göstərir.ASC və NLRP3-ün lokalizasiyasının sonrakı immunofluoresan tədqiqatları göstərdi ki, mənfi nəzarət qrupunda ASC zülalı bütün sitoplazmaya səpələnib və pcDNA3.1(+)-alfa-2-nin giardin və ya pcDNA3 ilə stimullaşdırılması zamanı nöqtə siqnalı kimi peyda olub.1(+)-alfa-7,3 giardin qrupu və ya GEV müsbət nəzarət qrupu (Şəkil 2d).Mənfi nəzarət və plazmidlə işlənmiş pcDNA 3.1 qruplarında NLRP3 zülal siqnalı aşkar edilmədi, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin və ya pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-ə cavab olaraq flüoresan siqnal nöqtəsi oldu. aşkar edilib..giardine sitoplazmada və ya HEV-in stimullaşdırılması zamanı aşkar edilir (Şəkil 2e).Bu məlumatlar daha sonra göstərir ki, G. duodenalis giardin alfa-2 və giardin alfa-7.3 siçanın birincil peritoneal makrofaqlarında NLRP3 iltihabını aktivləşdirir.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin və pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin siçan peritoneal makrofaqlarda NLRP3 iltihabını aktivləşdirir.Rekombinant eukaryotik ifadə plazmidləri pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin və pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardini ilkin siçan peritoneal makrofaqlarına və hüceyrələrinə köçürün və ya ekspressiya, oliqomerləşmənin təhlili üçün supernatantı 24 saat ərzində yığın. , ifrazat.və əsas iltihablı zülalların lokalizasiyası.Yalnız PBS (C) qrupu və pcDNA3.1 (+) tək müalicə qrupu mənfi nəzarət kimi, GEV müalicə qrupu isə müsbət qrup kimi istifadə edilmişdir.a NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspaz-1 və p20 kaspaz-1 daxil olmaqla əsas iltihabi zülallar NLRP3, Western blotlama üsulu ilə aşkar edilmişdir.b Supernatantlarda IL-1β sekresiya səviyyələri fermentlə əlaqəli immunosorbent analizindən (ELISA) istifadə etməklə müəyyən edilmişdir.Nəzarət və eksperimental qruplar arasındakı fərqlər SPSS proqram təminatının 22.0 versiyasından istifadə etməklə birtərəfli dispersiya təhlili (ANOVA) ilə təhlil edilmişdir.Ulduzlar qruplar arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir **P<0.01 və ***P<0.001.c Qranullardakı ASC oliqomerləşmə səviyyələri DSS çarpaz bağlama analizi ilə müəyyən edildi, hüceyrə lizatlarında ASC səviyyələri isə yükləmə nəzarəti kimi istifadə edildi.d İmmunofluoressensiyadan istifadə edərək ISC lokalizasiyasının vizuallaşdırılması.e NLRP3-ün lokalizasiyasını vizuallaşdırmaq üçün immunofluoressensiyadan istifadə edilmişdir.ASC, apoptotik ləkə kimi zülal;IL, interleykin;NLRP3, nukleotid bağlayan oliqomerizasiyaya bənzər reseptor 3;ns, əhəmiyyətli deyil (P > 0,05)
Həm G. duodenalis, həm də onun ifraz etdiyi GEV-lər NLRP3 iltihabını aktivləşdirir və in vitro ev sahibinin iltihab reaksiyalarını tənzimləyir.Beləliklə, G. duodenalisin patogenliyində NLRP3 iltihabının rolu qeyri-müəyyən olaraq qalır.Bu məsələni araşdırmaq üçün biz G. duodenalis kisti ilə yoluxmuş siçanlar və G. duodenalis kisti + MCC950 inhibitor müalicəsi ilə yoluxmuş siçanlar arasında eksperiment hazırladıq və G. duodenalis kistinə yoluxduqda NLRP3 inflammasome ifadəsini müqayisə etdik.Təcrübənin ətraflı sxemi Şəkil 3a-da göstərilmişdir.Müxtəlif müalicə qruplarında siçanların bədən çəkisindəki dəyişikliklər kistlərlə yoluxduqdan sonra 7 gün ərzində izlənilmiş və nəticələr Şəkil 3b-də göstərilmişdir.Saf PBS ilə müalicə olunan qrupla müqayisədə nəticələr göstərdi ki, (i) G. duodenalis kisti ilə yoluxmuş siçanların bədən çəkisi infeksiyadan sonra 3-cü gündən 7-ci günə qədər azalıb;(ii) MCC950 inhibitoru ilə müalicə siçanların bədən çəkisinə əhəmiyyətli təsir göstərməmişdir..Tək infeksiya qrupu ilə müqayisədə, MCC950 ilə müalicə olunan duodenal infeksiya qrupunun BW müxtəlif dərəcələrə qədər azalmışdır (1-ci gün: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2-ci gün: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001 3-cü gün: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 5, F: NO (3, 24)=0,6497, P=0,0645; 6-cı gün: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; 7-ci gün: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Bu məlumatlar göstərir ki, NLRP3 iltihabı siçanları onikibarmaq bağırsaq infeksiyasının erkən mərhələlərində (2-4 gün) əhəmiyyətli çəki itkisindən qoruyur.Daha sonra duodenal yuyulma mayesində G. duodenalis trofozoitlərini aşkarlamağı hədəflədik və nəticələr Şəkil 3c-də göstərilmişdir.G. duodenalis kist infeksiyası qrupu ilə müqayisədə, onikibarmaq bağırsağındakı trofozoitlərin sayı NLRP3 iltihabını blokladıqdan sonra əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (t (12) = 2,902, P = 0,0133).HE ilə boyanmış duodenal toxumalar, tək PBS və MCC950 ilə müalicə olunan mənfi nəzarətlə müqayisədə göstərdi: (i) G. duodenalis kist infeksiyası duodenal villi zədələnməsi ilə nəticələndi (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) və kript atrofiyası (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis kistləri ilə yoluxmuş və MCC950 inhibitorları ilə müalicə edilmiş siçanların onikibarmaq bağırsağı.duodenal villi zədələnmiş və ölü (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) atrofiyası və kript budaqlanması ilə (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Şəkil 3d-) f) .Bu nəticələr NLRP3 iltihabının G. duodenalisin patogenliyinin azaldılmasında rol oynadığını göstərir.
Giardia duodenum infeksiyasında NLRP3 iltihabının rolu.Siçanlar duodenokokk kistləri ilə gavaged (iv) və sonra MCC950 (ip) ilə və ya olmadan müalicə edildi.PBS və ya MCC950 ilə tək müalicə qrupları nəzarət kimi istifadə edilmişdir.Eksperimental qrup və müalicə rejimi.b Müxtəlif müalicə qruplarının hər birində siçanların bədən çəkisi 7 gün ərzində izlənildi.G. duodenalis infeksiya qrupu ilə G. duodenalis + MCC950 infeksiya müalicəsi qrupu arasındakı fərq SPSS proqram təminatının 22.0 versiyasından istifadə edərək t-testi ilə təhlil edilmişdir.Ulduz işarələri *P<0.05, **P<0.01 və ya ***P<0.001-də əhəmiyyətli fərqləri göstərir.c Parazitar yük duodenal yuyucu mayenin tərkibindəki trofozoitlərin sayının hesablanması ilə müəyyən edilmişdir.G. duodenalis infeksiya qrupu ilə G. duodenalis + MCC950 infeksiya müalicəsi qrupu arasındakı fərq SPSS proqram təminatının 22.0 versiyasından istifadə edərək t-testi ilə təhlil edilmişdir.Ulduzlar *P <0,05-də əhəmiyyətli fərqləri göstərir.d Duodenal histopatologiyanın hematoksilin və eozin (H&E) ilə boyanmasının nəticələri.Qırmızı oxlar villi, yaşıl oxlar kriptlərin zədələnməsini göstərir.Ölçək çubuğu: 100 µm.e, f Duodenal villusun hündürlüyünün və siçan kriptinin hündürlüyünün statistik təhlili.Ulduz işarələri *P<0.05 və **P<0.01-də əhəmiyyətli fərqləri göstərir.Nəticələr 7 müstəqil bioloji təcrübədən götürülüb.BW, bədən çəkisi;ig, mədədaxili çatdırılma yolu;ip, intraperitoneal çatdırılma marşrutu;ns, əhəmiyyətli deyil (P > 0,05);PBS, fosfat tamponlu şoran;WT, vəhşi tip
IL-1β-nin ifrazı iltihabın aktivləşməsinin əlamətidir.G. duodenalis alfa-2 giardinin və alfa-7.3 giardinin in vivo NLRP3 host inflammasome-ni aktivləşdirib-aktiv etdiyini müəyyən etmək üçün biz müalicə olunmamış WT siçanlarından (saxta qrup) və NLRP3 iltihabı bloklayan siçanlardan (MCC950 inhibe edilmiş müalicə qrupu) istifadə etdik.Təcrübənin ətraflı sxemi Şəkil 4a-da göstərilmişdir.Eksperimental qruplar PBS, G. duodenalis kistinin qavaj üsulu ilə müalicəsi, pcDNA3.1-in əzələdaxili yeridilməsi və pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinin və ya pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinin əzələdaxili yeridilməsi ilə müalicə olunan siçanlardan ibarət idi.Rekombinant plazmidin əzələdaxili yeridilməsindən sonra 7-ci gündə zərdab toplanmış və hər qrupda IL-1β səviyyəsi müəyyən edilmişdir.Şəkil 4b-də göstərildiyi kimi, MOCK qrupunda: (i) PBS qrupu ilə müqayisədə, pcDNA3.1 müalicəsi IL-1β sekresiyasına əhəmiyyətli təsir göstərməmişdir (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), lakin, IL-β sekresiyası G. duodenalis kist qrupunda (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardin və pcDNA3-də əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlmişdir.1- alfa-7.3 giardinin əzələdaxili yeridilməsi serum IL-1β səviyyələrini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin, pcDNA3.1-alfa-2 giardin əzələdaxili enjeksiyon qrupunda yüksək səviyyələrdə IL-1β ifrazına səbəb oldu (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.033) .MCC950 müalicə qrupu və MOCK qrupundakı hər qrupla müqayisədə: (i) PBS nəzarət qrupu və pcDNA3.1 nəzarət qrupunda IL-1β sekresiya səviyyələri MCC950 inhibitorunun bloklanmasından sonra müəyyən dərəcədə azaldı, lakin fərq yox idi. əhəmiyyətli (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 bloklandıqdan sonra., IL-1β sekresiyası G. duodenalis kista ilə yoluxmuş qrupda, pcDNA3.1-alfa-2 giardin qrupunda və pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin qrupunda (G. duodenalis: ANOVA, F(9) əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır. , 58) = 3.540 , P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANO8; ) = 3.540, P = 0.0164).Bu nəticələr alfa-2 giardin və alfa-7.3 giardinin in vivo NLRP3 iltihabının aktivləşdirilməsinə vasitəçilik etdiyini göstərir.
pcDNA3.1(+)-giardines in vivo NLRP3 host inflammasomunu aktivləşdirir.Siçanlar rekombinant eukaryotik ifadəli plazmid pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine və ya pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ilə immunizasiya edildi (IM) və sonra MCC950 (ip; MCC950 qrupu) və ya yox (dummy qrup) ilə müalicə edildi. ).PBS və ya pcDNA3.1 (+) plazmid müalicəsi qrupu mənfi nəzarət kimi, G. duodenalis kistinin müalicəsi qrupu müsbət nəzarət kimi istifadə edilmişdir.Eksperimental qrup və müalicə rejimi.b Siçanlarda IL-1β-nın serum səviyyələri 7-ci gündə ELISA analizi ilə ölçüldü.MOCK qrupundakı qruplar arasındakı fərqlər birtərəfli ANOVA istifadə edərək, MOCK qrupu ilə MCC950 qrupu arasındakı fərqlər SPSS proqram təminatının 22.0 versiyasının t-testindən istifadə etməklə təhlil edilmişdir.Ulduz işarələri MOCK qrupunda müalicə qrupları arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir, *P<0.05 və ***P<0.001;dollar işarələri ($) P<0.05 səviyyəsində MOCK qrupundakı hər qrup və MCC950 qrupu arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir.Yeddi müstəqil bioloji təcrübənin nəticələri.i, əzələdaxili inyeksiya, ns, əhəmiyyətli deyil (P > 0,05)
NLRP3 host inflammasome-nin alfa-2 və alfa-7.3 giardin vasitəçiliyi ilə aktivləşdirilməsinin G. duodenalis infeksiyasına təsirini araşdırmaq üçün biz WT C57BL/6 siçanlarından istifadə etdik və alfa-2 giardin və alfa-7.3 giardin yeritdik.plazmid əzələdaxili, 3 gündən sonra G. duodenalis kistinin mədə borusu vasitəsilə yeridilmiş, bundan sonra siçanlar 7 gün ərzində müşahidə edilmişdir.Təcrübənin ətraflı sxemi Şəkil 5a-da göstərilmişdir.Hər bir siçanın bədən çəkisi hər gün ölçülür, mədə borusu vasitəsilə yeridildikdən sonra 7-ci gündə təzə duodenal toxuma nümunələri toplanır, trofozoitlərin sayı ölçülür və histopatoloji dəyişikliklər müşahidə edilir.Şəkil 5b-də göstərildiyi kimi, artan qidalanma vaxtı ilə, hər qrupda siçanların BW tədricən artmışdır.Siçanların MT-si G. duodenalis kistlərinin mədədaxili tətbiqindən sonra 3-cü gündə azalmağa başladı və sonra tədricən artdı.Alfa-2 giardin və alfa7.3 giardinin əzələdaxili yeridilməsi ilə törədilən NLRP3 iltihabının aktivləşdirilməsi siçanlarda çəki itkisini əhəmiyyətli dərəcədə zəiflətdi (1-ci gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 1. = 0 .9754 1-ci gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 2-ci gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979 2-ci gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 3-cü gün: pcDNA3.1-alfa-2 giard, 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 3-cü gün: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 4-cü gün: pcDNA3.1-alpha; , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, 4-cü gün: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, 5-ci gün: pcDNA3.1-alpha 2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 5-ci gün: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 6-cı gün: pc -DNA alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, 6-cı gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;7-ci gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 7-ci gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, <0,0001).Parazitar yük onikibarmaq bağırsaqda qiymətləndirilmişdir (Şəkil 5c).Müalicə olunmamış müsbət nəzarət və boş pcDNA3.1 vektoru yeridilmiş qrupla müqayisədə, α-2 giardin və α-7,3 giardin (pcDNA3.1-alfa) yeridilmiş qruplarda G. duodenalis trofozoitlərinin sayı əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır. -2 giardin : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Bundan əlavə, giardine alfa-7.3 siçanlarda giardin alfa-2-dən daha qoruyucu idi (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).HE boyanmasının nəticələri əncirdə göstərilmişdir.5d-f.Alfa-2 giardin və alfa-7.3 giardin yeridilmiş siçanlarda G. duodenalis inyeksiya edilmiş siçanlarla və boş pcDNA3 vektoru ilə birlikdə G. duodenalis yeridilmiş siçanlarla müqayisədə villusun zədələnməsi ilə özünü göstərən duodenal toxuma lezyonları daha az olmuşdur .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 və ya P = 0.0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2.46 = 0,0028 və ya P = 0,0055) və azalmış kript atrofiyası (pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 və ya P = 0.0158; pcDNA3.1-alphain: A3VA- , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 və ya P = 0.0191).Bu nəticələr göstərir ki, alfa-2 giardin və alfa-7,3 giardin in vivo NLRP3 iltihabını aktivləşdirməklə G. duodenalisin yoluxuculuğunu azaldır.
G. duodenalis infeksiyasında pcDNA3.1(+)-giardinlərin rolu.Siçanlar rekombinant eukaryotik ifadəli plazmidlər pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine və ya pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ilə immunizasiya edildi (IM) və sonra G. duodenalis kistləri (ig) ilə etiraz edildi.PBS qrupu və pcDNA3.1(+) + duodenal kist müalicəsi qrupu mənfi nəzarət qrupu, duodenal kist müalicəsi qrupu isə müsbət nəzarət qrupu kimi istifadə edilmişdir.Eksperimental qrup və müalicə rejimi.b Müxtəlif müalicə qruplarının hər birində siçanların MT-si çağırışdan sonra 7 gün ərzində monitorinq edildi.Ulduz işarələri G. duodenalis qrupu ilə pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin qrupundakı qruplar arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir, *P <0.05, **P <0.01 və ***P <0.001;dollar işarəsi ($) G. duodenalisin hər qrupu ilə pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine qrupu, $$P<0.01 və $$$P<0.001 arasında əhəmiyyətli fərqi göstərir.c Parazitar yük onikibarmaq bağırsaqdan 1 ml duodenal lavajda (uzunluğu 3 sm) trofozoitlərin sayının hesablanması ilə müəyyən edilir və onikibarmaq bağırsağın hər sm-ə düşən parazitlərin sayı ilə ifadə edilir.G. duodenalis infeksiya qrupu, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin qrupu və pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin qrupu arasındakı fərqlər SPSS proqram təminatı versiyası 22.0 istifadə edərək birtərəfli ANOVA ilə təhlil edilmişdir.Ulduz işarələri **P<0.01 və ***P<0.001-də əhəmiyyətli fərqləri göstərir.d duodenumda histopatoloji dəyişikliklər.Qırmızı oxlar villi, yaşıl oxlar kriptlərin zədələnməsini göstərir.Ölçək çubuğu: 100 µm.e, f Siçan duodenal villus hündürlüyünün (e) və kript hündürlüyünün (f) statistik təhlili.Şəkil 1d-dəki qruplar arasındakı fərqlər SPSS proqram təminatının 22.0 versiyasından istifadə edərək birtərəfli ANOVA ilə təhlil edilmişdir.Ulduz işarələri *P<0.05 və **P<0.01-də əhəmiyyətli fərqləri göstərir.Yeddi müstəqil bioloji təcrübənin nəticələri.ns, əhəmiyyətli deyil (P > 0,05)
Giardia duodenum insan və digər məməlilərin bağırsaq parazitidir və lyamblioz xəstəliyinə səbəb olur.2004-cü ildə, xüsusilə aşağı sosial-iqtisadi statuslu icmalarda 6 il ərzində yüksək yayılması səbəbindən ÜST-nin Baxımsız Xəstəliklər Təşəbbüsünə daxil edilmişdir [32].Anadangəlmə immun sistemi G. duodenalis infeksiyasına qarşı immun cavabında mühüm rol oynayır.Siçan makrofaqlarının hüceyrədənkənar tələləri buraxaraq G. duodenalis-i udduğu və öldürdüyü bildirilmişdir [33].Əvvəlki araşdırmalarımız göstərdi ki, qeyri-invaziv hüceyrədənkənar parazit olan G. duodenalis, ev sahibinin iltihab reaksiyalarını tənzimləmək üçün siçan makrofaqlarında p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 və NLRP3 iltihab siqnal yollarını aktivləşdirir və sərbəst buraxılan GEV bu prosesi gücləndirə bilər.13], 24].Bununla belə, GEV-də NLRP3 iltihabı ilə tənzimlənən iltihabda iştirak edən dəqiq PAMP-lar və lyambliozda NLRP3 iltihabının rolu hələ də aydınlaşdırılmalıdır.Bu iki suala aydınlıq gətirmək üçün bu araşdırmanı apardıq.
NLRP3 iltihabı immun hüceyrələrinin sitoplazmasında yerləşir və sidik turşusu kristalları, toksinlər, bakteriyalar, viruslar və parazitlər kimi müxtəlif hissəciklər tərəfindən aktivləşdirilə bilər.Bakterial tədqiqatlarda toksinlər iltihab sensorlarını aktivləşdirən, iltihaba və hüceyrə ölümünə səbəb olan əsas PAMP kimi müəyyən edilmişdir [34].Staphylococcus aureus [35] və Escherichia coli [36] hemolizin, enterotoksindən (NHE) [37] hemolizin BL (HBL) [37] kimi bəzi struktur cəhətdən müxtəlif toksinlər NLRP3 iltihabının aktivləşməsinə səbəb olur.Viral tədqiqatlar göstərdi ki, SARS-COV-2 zərfi (E) zülalı [38] və Zika virusu NS5 zülalı [39] kimi virulent zülallar NLRP3 reseptoru tərəfindən tanınan mühüm PAMPlardır.Parazit tədqiqatlarında Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] və Leishmania [42] kimi bir çox parazitin ev sahibinin iltihabının aktivləşməsi ilə əlaqəli olduğu bildirilmişdir.Toxoplasma gondii-nin virulentliyi ilə əlaqəli sıx qranul zülalları GRA35, GRA42 və GRA43 Lewis siçovul makrofaqlarında piroptozun induksiyası üçün tələb olunur [43].Bundan əlavə, bəzi Leishmania tədqiqatları parazit membran lipofosfoglikan [44] və ya sink metalloproteaz [45] kimi NLRP3 iltihabında iştirak edən fərdi molekullara diqqət yetirmişdir.Annexinə bənzəyən alfa-giardin ailəsi arasında alfa-1 giardinin siçan modelində G. duodenalis-ə qarşı müdafiəni təmin edən potensial peyvənd namizədi olduğu göstərilmişdir [18].Tədqiqatımızda G. duodenalis virulentlik faktorları alfa-2 və alfa-7,3 lyambdiyalarını seçdik ki, bunlar giardia üçün unikaldır, lakin nisbətən az məlumat verilir.Bu iki hədəf gen iltihabın aktivləşdirilməsinin təhlili üçün pcDNA3.1(+) eukaryotik ifadə sistemi vektoruna klonlaşdırılıb.
Siçan modelimizdə parçalanmış kaspaz fraqmentləri iltihabın aktivləşməsinin markerləri kimi xidmət edir.Stimullaşdırıldıqdan sonra NLRP3 ASC ilə qarşılıqlı əlaqə qurur, prokaspazaları cəlb edir və pro-IL-1β və pro-IL-18-i müvafiq olaraq yetkin IL-1β və IL-18-ə parçalayan aktiv kaspazlar yaradır.İltihabi kaspazlar (kaspazlar-1, -4, -5 və -11) anadangəlmə müdafiə üçün vacib olan və iltihabda və proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümündə iştirak edən sistein proteazlarının qorunmuş bir ailəsidir [46].Kaspaza-1 kanonik iltihablar [47] tərəfindən aktivləşdirilir, kaspaza-4, -5 və -11 isə atipik iltihabların əmələ gəlməsi zamanı parçalanır [48].Bu işdə biz bir model olaraq siçan peritoneal makrofaqlardan istifadə etdik və G. duodenalis infeksiyası tədqiqatlarında ana NLRP3 iltihabının aktivləşdirilməsinin markeri kimi p20 kaspaz-1 parçalanmış kaspaz-1-i araşdırdıq.Nəticələr göstərdi ki, bir çox alfa-giardin iltihabın tipik aktivləşməsindən məsuldur ki, bu da bakteriya və viruslarda iştirak edən əsas virulentlik molekullarının kəşfinə uyğundur.Bununla belə, bizim tədqiqatımız yalnız ilkin ekrandır və qeyri-klassik iltihabı aktivləşdirə bilən başqa molekullar da var, çünki bizim əvvəlki tədqiqatımız G. duodenalis infeksiyasında həm klassik, həm də qeyri-klassik iltihabı aşkar edib [13].Yaranan p20 kaspaz-1-in NLRP3 iltihabı ilə əlaqəli olub-olmadığını müəyyən etmək üçün biz alfa-2 və alfa-7.3 giardinləri siçan peritoneal makrofaqlarına köçürdük və əsas molekul zülal ifadə səviyyələrini və ASC oliqomerizasiya səviyyələrini təyin etdik və hər iki α-giardinin aktivləşdiyini təsdiqlədik. iltihablı NLRP3.Nəticələrimiz yalnız G. muris və ya E. coli EPEC ştammları ilə Caco-2 hüceyrələrinin stimullaşdırılmasının NLRP3, ASC və kaspaza-1-in flüoresans intensivliyini artıra biləcəyini bildirən Manko-Prykhoda və başqalarının nəticələrindən bir qədər fərqlidir. əhəmiyyətli dərəcədə olmasa da, G. muris və E. coli-nin kostimulyasiyası üç zülalın səviyyəsini necə artırdı [49].Bu uyğunsuzluq Giardia növlərinin, hüceyrə xətlərinin və ilkin hüceyrələrin seçimindəki fərqlərlə bağlı ola bilər.Biz həmçinin G. duodenalis-ə daha çox həssas olan 5 həftəlik qadın WT C57BL/6 siçanlarında MCC950 istifadə edərək in vivo analizlər apardıq.MCC950, nanomolyar konsentrasiyalarda kanonik və qeyri-kanonik NLRP3 aktivasiyasını bloklayan güclü və selektiv kiçik molekul NLRP3 inhibitorudur.MCC950 NLRP3 aktivasiyasını maneə törədir, lakin AIM2, NLRC4 və NLRP1 iltihab yollarının və ya TLR siqnal yollarının aktivləşdirilməsinə təsir göstərmir [27].MCC950 NLRP3 aktivasiyasını bloklayır, lakin NLRP3 başlamasına, K+ axınına, Ca2+ axınına və ya NLRP3 və ASC arasında qarşılıqlı əlaqəyə mane olmur;əvəzinə, ASC oliqomerizasiyasını bloklayaraq NLRP3 iltihabının aktivləşdirilməsini maneə törədir [27].Buna görə də, giardin inyeksiyasından sonra NLRP3 iltihabının rolunu müəyyən etmək üçün in vivo tədqiqatda MCC950-dən istifadə etdik.Aktivləşdirilmiş kaspaza-1 p10 iltihab əleyhinə pro-IL-1β və pro-IL-18 sitokinlərini yetkin IL-1β və IL-18-ə parçalayır [50].Bu işdə, MCC950 ilə və ya olmayan giardinlə müalicə edilmiş siçanlarda serum IL-1β səviyyələri NLRP3 iltihabının aktiv olub-olmamasının göstəricisi kimi istifadə edilmişdir.Gözlənildiyi kimi, MCC950 müalicəsi serum IL-1β səviyyələrini əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb.Bu məlumatlar G. duodenalis giardin alfa-2 və giardin alfa-7.3-ün NLRP3 siçan iltihabını aktivləşdirməyə qadir olduğunu açıq şəkildə nümayiş etdirir.
Son onillikdə toplanmış mühüm məlumatlar göstərmişdir ki, IL-17A G. muris-ə qarşı immunitetin əsas tənzimləyicisidir, IL-17RA siqnalını induksiya edir, antimikrob peptidlər istehsal edir və komplementin aktivləşdirilməsini tənzimləyir [51].Bununla belə, Giardia infeksiyası gənc yetkinlərdə daha tez-tez baş verir və gənc siçanlarda Giardia infeksiyasının qoruyucu təsir göstərmək üçün IL-17A cavabını aktivləşdirmədiyi bildirilmişdir [52], tədqiqatçıları digər immunomodulyator Giardia axtarmağa sövq edir.helmint infeksiyasının mexanizmləri.Son tədqiqatın müəllifləri bildirdilər ki, G. muris E. coli EPEC tərəfindən NLRP3 iltihabını aktivləşdirə bilər ki, bu da antimikrob peptidlərin istehsalını təşviq edir və onun yapışma qabiliyyətini və bağırsaq traktında trofozoitlərin sayını azaldır və bununla da qalın bağırsağın şiddətini azaldır. basillərin törətdiyi xəstəliklər [49 ].NLRP3 iltihabı müxtəlif xəstəliklərin inkişafında iştirak edir.Tədqiqatlar göstərdi ki, Pseudomonas aeruginosa hüceyrə ölümünün qarşısını almaq üçün makrofaqlarda autofagiyaya səbəb olur və bu proses NLRP3 iltihabının aktivləşməsindən asılıdır [53].N. caninum üçün NLRP3 iltihabının reaktiv oksigen növlərinin vasitəçiliyi ilə aktivləşməsi onun ev sahibində təkrarlanmasını məhdudlaşdırır və onu potensial terapevtik hədəfə çevirir [9].Paracoccidioides brasiliensis-in siçan sümük iliyindən qaynaqlanan dendritik hüceyrələrdə NLRP3 iltihabının aktivləşməsinə səbəb olduğu, nəticədə ev sahibinin müdafiəsində mühüm rol oynayan iltihablı sitokin IL-1β-nın sərbəst buraxılması aşkar edilmişdir [10].Bir neçə Leishmania növləri, o cümlədən L. amazonensis, L. major, L. braziliensis və L. infantum chagasi, makrofaqlarda NLRP3 və ASC-dən asılı kaspaza-1-i, həmçinin Leishmania infeksiyasını aktivləşdirir.NLRP3/ASC/caspase-1 genində çatışmayan siçanlarda parazitlərin təkrarlanması artır [11].Zamboni və b.Leishmania infeksiyasının hüceyrədaxili parazit replikasiyasını məhdudlaşdıran makrofaqlarda NLRP3 iltihabının aktivləşməsinə səbəb olduğu bildirildi.Beləliklə, Leishmania qaçınma strategiyası olaraq NLRP3 aktivasiyasını maneə törədə bilər.In vivo tədqiqatlarda NLRP3 iltihabı Leishmania-nın aradan qaldırılmasına kömək etdi, lakin toxumalara təsir etmədi [54].Əksinə, helmintoz tədqiqatlarında NLRP3 iltihabının aktivləşdirilməsi ev sahibinin mədə-bağırsaq helmintozuna qarşı qoruyucu toxunulmazlığını sıxışdırdı [12].Şigella bütün dünyada ishala səbəb olan əsas bakteriyalardan biridir.Bu bakteriyalar P2X7 reseptor vasitəçiliyi ilə K+ axını, reaktiv oksigen növləri, lizosomal turşulaşma və mitoxondrial zədələnmə yolu ilə IL-1β istehsalına səbəb ola bilər.NLRP3 iltihabı faqositoz və makrofaqların Şigellaya qarşı bakterisid fəaliyyətini mənfi tənzimləyir [55].Plazmodium tədqiqatları göstərmişdir ki, Plasmodium ilə yoluxmuş AIM2, NLRP3 və ya kaspaza-1 çatışmazlığı olan siçanlar yüksək səviyyədə tip 1 interferon istehsal edir və Plasmodium infeksiyasına daha davamlıdır [56].Bununla belə, siçanlarda NLRP3 iltihabının patogen aktivləşdirilməsində alfa-2 giardinin və alfa-7.3 giardinin rolu aydın deyil.
Bu tədqiqatda, MCC950 tərəfindən NLRP3 iltihabının inhibə edilməsi BW-ni azaltdı və siçanlarda bağırsaq yuyulma mayesində trofozoitlərin sayını artırdı, nəticədə onikibarmaq bağırsağın toxumasında daha ciddi patoloji dəyişikliklər baş verdi.Alpha-2 giardine və alpha-7.3 giardine ev sahibi siçan NLRP3 iltihabını aktivləşdirir, siçanın bədən çəkisini artırır, bağırsaq yuyulma mayesində trofozoitlərin sayını azaldır və onikibarmaq bağırsağın patoloji lezyonlarını yüngülləşdirir.Bu nəticələr göstərir ki, G. duodenalis siçanlarda G. duodenalisin patogenliyini azaldaraq, alfa-2 giardin və alfa-7,3 giardin vasitəsilə NLRP3 host inflammasomunu aktivləşdirə bilər.
Nəticələrimiz toplu şəkildə nümayiş etdirir ki, alfa-2 və alfa-7.3 lyambardınları NLRP3 host inflammasomunun aktivləşməsinə səbəb olur və siçanlarda G. duodenalisin yoluxuculuğunu azaldır.Buna görə də, bu molekullar lyambliozun qarşısının alınması üçün perspektivli hədəflərdir.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: ümumi baxış.Bu yaxınlarda məlum oldu ki, Pat İnflamm dərmanlara qarşı allergiyası var.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: farmakoterapiyaya baxış.Əczaçının ekspert rəyi.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, dərman müqaviməti və yeni hədəflərin kəşfi.Disord dərman hədəflərini yoluxdurur.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, və s. NLRP3 inflammasome və iltihabi xəstəliklər.Oksid Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Bağırsaq iltihabında və xərçəngdə iltihabın rolu.Qastroenterologiya.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. İmmun tolerantlıq və bağırsaq iltihabının kəsişməsində kanonik və atipik NLRP3 iltihab aktivləşməsi.pre-immun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-vasitəçiliyi ilə NLRP3 inflammasome aktivləşdirilməsi N. caninum infeksiyasına cavab olaraq iştirak edir.Parazit vektoru.2020;13:449.